注射用頭孢西丁鈉無菌檢查方法適用性試驗

王林　石晶萍　黃加秀　謝春娟（揚子江藥業(yè)集團有限公司，江蘇泰州225321）

注射用頭孢西丁鈉無菌檢查方法適用性試驗

王林石晶萍黃加秀謝春娟
（揚子江藥業(yè)集團有限公司，江蘇泰州225321）

【摘要】目的：建立注射用頭孢西丁鈉無菌檢查的方法適用性試驗。方法：參照《中國藥典》2015年版無菌檢查法中的薄膜過濾法進行試驗，通過沖洗量和β-內(nèi)酰胺酶加入量等條件的優(yōu)化，建立該品種的無菌檢查方法。結(jié)果：以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液，約每管800 mL的沖洗量，每管培養(yǎng)基中加入β-內(nèi)酰胺酶2 mL，可以消除頭孢西丁鈉的抑菌作用。結(jié)論：該方法有效可行，可用于該品種的無菌檢查。

【關(guān)鍵詞】注射用頭孢西丁鈉；無菌檢查；方法適用性試驗

頭孢西丁鈉是由鏈霉素產(chǎn)生的甲氧頭孢菌素C經(jīng)半合成制得的一類新型頭霉素類抗生素，對革蘭陰性菌有較強的抗菌作用，具有高度抗β-內(nèi)酰胺酶的性質(zhì)。臨床主要用于敏感菌所致的心內(nèi)膜炎，呼吸道感染以及骨、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等感染的治療［1-3］。

根據(jù)《中國藥典》2015年版的要求，所有用于市場銷售的注射制劑必須進行無菌檢查且合格。當進行產(chǎn)品的無菌檢查時，應(yīng)進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查［5］。目前注射用頭孢西丁鈉的無菌檢查方法在國內(nèi)尚無文獻報道。據(jù)此，本文建立了注射用頭孢西丁鈉無菌檢查的方法，并進行了方法適用性試驗。

1　材料

1.1儀器

ZH-2型旋渦混合儀（上海滬西醫(yī)療儀器廠）；HTY-601型智能集菌儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；NKF330型全封閉集菌培養(yǎng)器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；KB400型生化培養(yǎng)箱（德國賓得公司）。

1.2樣品與試劑

注射用頭孢西丁鈉（批號：15082831，15091831，15091931），由揚子江藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)。

0.9%無菌氯化鈉溶液（批號：15031541）、pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：15090141），均為自制。

β-內(nèi)酰胺酶（批號：130441-201502），由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3試驗用菌種（第4代）

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501，大腸埃希菌CMCC（B）44102，生孢梭菌CMCC（B）64941，白色念珠菌CMCC （F）98001，黑曲霉菌 CMCC（F）98003，銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，均來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.4培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：20150820），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：20150828），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：20150916），硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號：20150810），均由北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司提供。

2　方法與結(jié)果

2.1菌液制備

分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～ 35℃培養(yǎng)18～ 24 h；接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～ 24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～ 25℃培養(yǎng)24～ 48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1 mL含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，20～ 25℃培養(yǎng)5～ 7 d，使大量孢子產(chǎn)生，加入3～ 5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液（管口帶有薄的無菌棉花過濾菌絲）至滅菌試管內(nèi)，用含 0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將菌液稀釋至每1 mL小于100 cfu的菌懸液，備用［5］。結(jié)果見表1。

表1　驗證用菌液計數(shù)結(jié)果　（cfu）

2.2培養(yǎng)基的靈敏度檢查

取每管 12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于 100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照；取每管9 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100 cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果，見表2。

表2　培養(yǎng)基靈敏度檢查結(jié)果　（d）

2.3培養(yǎng)基的無菌性檢查

取兩種培養(yǎng)基各5瓶，置于各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14 d，均無菌生長。判該批硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的無菌性檢查符合規(guī)定。

2.4驗證方法——薄膜過濾法

2.4.1操作方法用0.9%無菌氯化鈉溶液50 mL潤濕集菌培養(yǎng)器的濾膜，以發(fā)揮濾膜的最大過濾效率。將30瓶樣品用0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后平行抽入集菌培養(yǎng)器的3支濾筒內(nèi)，過濾。每張濾膜過濾量為10瓶。每只培養(yǎng)器的濾筒用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱“緩沖液”）沖洗，100 mL/次，邊沖洗邊振搖。在最后一次沖洗液中加入1 mL小于100 cfu的試驗菌過濾，將胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基加至集菌培養(yǎng)器的濾筒內(nèi)，每個濾筒內(nèi)加入適量β-內(nèi)酰胺酶，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

2.4.2預(yù)試驗組選擇金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為預(yù)試驗組的敏感菌株，取30瓶供試品按“2.2.1”操作步驟進行操作，每個集菌管沖洗量、加入的β-內(nèi)酰胺酶量及試驗結(jié)果見表3。

表3　預(yù)試驗結(jié)果

由表3可知，當每個集菌培養(yǎng)器的濾筒用700，800 mL緩沖液沖洗并加1mL β-內(nèi)酰胺酶進行操作時，含白色念珠菌的集菌培養(yǎng)器在規(guī)定時間內(nèi)是不生長的；而當用每管沖800 mL緩沖液加2 mL β-內(nèi)酰胺酶和每管沖1 000 mL緩沖液加1 mL β-內(nèi)酰胺酶的方法進行操作時，含金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的集菌培養(yǎng)器均生長良好。因此沖洗800 mL緩沖液加2 mL β-內(nèi)酰胺酶和沖洗1 000 mL緩沖液加1 mL β-內(nèi)酰胺酶的沖洗條件都是可行的，但考慮到?jīng)_洗量越大，越可能對濾膜造成損壞，越易造成對結(jié)果的誤判，故最終選用800 mL緩沖液加2 mL β-內(nèi)酰胺酶對6種試驗菌進行3次平行試驗。

2.4.3平行試驗組1次試驗取30瓶供試品按“2.2.1”操作方法進行操作，每管沖洗800 mL緩沖液，取3批不同的批號樣品分別進行3次獨立平行試驗，并在每管最后一次沖洗液中加入1 mL小于100 cfu金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，再向集菌培養(yǎng)器中加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL及2 mL β-內(nèi)酰胺酶。具體結(jié)果見表4。

表4　3批平行試驗結(jié)果

由表4可知，3批平行試驗中，含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及生孢梭菌的集菌培養(yǎng)器均在24 h內(nèi)生長良好，含枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉菌的集菌培養(yǎng)器均在24～ 48 h內(nèi)生長良好。結(jié)果表明，在此沖洗條件下能夠消除頭孢西丁鈉的抑菌作用。

2.5樣品的無菌檢查

另取注射用頭孢西丁鈉30瓶按 “2.2.1”操作方法進行操作，每管用800 mL緩沖液沖洗，最后向1支含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器中加入1 mL小于100 cfu的大腸埃希菌［4-5］，3支集菌培養(yǎng)器分別按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d，每日觀察，結(jié)果符合規(guī)定。

3　討論

通過“2.4.3”和“2.5”可以看出，每管沖800 mL緩沖液加 2 mL β-內(nèi)酰胺酶和每管沖 1 000 mL緩沖液加1 mL β-內(nèi)酰胺酶的方法都能消除頭孢西丁鈉的抑菌作用，對試驗結(jié)果不會造成影響。但考慮到無菌檢查中沖洗量越大，對濾膜的損傷越大，故最終選用每管沖800 mL緩沖液加 2 mL β-內(nèi)酰胺酶的方法用于注射用頭孢西丁鈉日常的無菌檢查。

參考文獻：

［1］ 尹偉成，彭東明，周汨，等.頭孢西丁鈉的合成工藝改進［J］.中國新藥雜志，2014，23（24）：2930-2932.

［2］ 尹偉成，彭東明，周汨，等.頭孢西丁鈉的合成進展［J］.精細化工中間體，2014，4（44）：18-22.

［3］任冰，徐英春，謝秀麗，等.頭孢西丁對210株細菌的體外抑菌活性［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，1999，1（9）：55-56.

［4］ 張新妹，李會輕，胡昌情，等.無菌檢查法中有關(guān)陽性對照菌規(guī)定的探討［J］.中國藥師，2003，6（11）：730-732.

［5］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （2015年版）四部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：附錄136-140.

◆醫(yī)藥快訊◆

EMA批準治療發(fā)作性睡病藥物Pitolisant上市

歐洲藥品評審局（EMA）于2016年3月31日批準 Bioprojet制藥公司的 Pitolisant（商品名：Wakix）片劑上市，用于治療成人伴或不伴猝倒的發(fā)作性睡病。

Pitolisant為組胺H3受體拮抗藥/反向激動藥，通過阻斷組胺自身受體增強腦部組胺能神經(jīng)元的活性。Pitolisant還可調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，增加腦內(nèi)乙酰膽堿、去甲腎上腺素、多巴胺的釋放。

Pitolisant的有效性主要通過2項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照、平行組對照試驗（Harmony I、Harmony CTP）確定，試驗時長8周。Harmony I試驗使用Epworth嗜睡量表（ESS）作為首要療效標準評估Pitolisant對白日睡眠過多（EDS）的作用。試驗結(jié)果顯示，Pitolisant組ESS評分變化顯著優(yōu)于安慰劑組，但與莫達非尼組相比無顯著差別，Pitolisant組猝倒發(fā)作頻率亦較安慰劑組顯著降低。Harmony CTP試驗的首要療效終末指標為試驗結(jié)束時穩(wěn)定治療期4周與基線期2周相比，每周平均猝倒發(fā)作次數(shù)的變化。試驗結(jié)果顯示，Pitolisant組每周猝倒發(fā)作頻率顯著低于安慰劑組，Pitolisant組ESS評分降低亦顯著優(yōu)于安慰劑組。

Pitolisant最常見的不良反應(yīng)為失眠、頭痛、惡心、焦慮、易激惹、頭暈、抑郁、震顫、睡眠障礙、疲勞、嘔吐、眩暈、消化不良、體質(zhì)量增加和上腹疼痛。

（來源：http://www.ema.europa.eu）

doi：10.3969/j.issn.1672-5433.2016.08.005

收稿日期：（2016-03-14）

作者簡介：石晶萍，女，副高級工程師。研究方向：藥品檢驗。通訊作者E-mail：sjp@yangzijiang.com

Suitability Test on Method for Sterility Test of Cefoxitin Sodium for Injection

Wang Lin，Shi Jingping，Huang Jiaxiu，Xie Chunjuan（Yangtze River Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Jiangsu Taizhou 225321，China）

ABSTRACTObjective：To establish a suitability test on method for sterility test of cefoxitin sodium for injection. Methods：According to the requirements in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition），the method for sterility test of cefoxitin sodium for injection was validated by membrane-filter procedure.The method of the variety are established by choosing washing volumes and adding β-lactamasein sterlity test.Results：When using pH 7.0 sterile sodium chloride-peptone buffer as a washing solution，800 mL for each tube，a portion of 2 mL of β-lactamase was added into each tube，the bacteriostatic action of cefoxitin sodium can be eliminated.Conclusion：The developed method was effective and feasible，which was suitable for sterility test of cefoxitin sodium for injection.

KEY WORDSCefoxitin Sodium for Injection；Sterility Test；Method Suitability Test