基于質量源于設計理念建立高效液相色譜方法

楊家愛曹天海（昆明醫科大學第一附屬醫院藥劑科，云南 昆明 65003；昆明積大制藥股份有限公司國際GMP認證部，65006）

基于質量源于設計理念建立高效液相色譜方法

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（1昆明醫科大學第一附屬醫院藥劑科，云南 昆明 650032；2昆明積大制藥股份有限公司國際GMP認證部，650106）

【摘要】質量源于設計理念在制藥工業中的應用逐漸由工藝開發向藥物分析領域滲透，高效液相色譜法（HPLC）作為藥物分析領域內的重要工具，其方法開發的科學性、規范性尤其應當受到重視。本文對質量源于設計在HPLC方法開發中的應用作一綜述。

【關鍵詞】質量源于設計；高效液相色譜法；綜述

隨著美國FDA把質量源于設計 （quality by design，QbD）［1］引入制藥行業，上述概念在原料藥工藝開發和制劑工藝研究中得到了廣泛的應用。高效液相色譜法（HPLC）作為快速、準確、可靠的分析方法，在藥品質量控制中起著極其重要的作用。近年來，有研究逐漸把質量源于設計的概念引入HPLC開發領域，本文總結了相關文獻的研究思路。

傳統的HPLC開發過程［2］為：①確定分離目標，②初步分離，③建立最佳分離條件，④優化分離條件，⑤方法驗證。基于QbD的HPLC開發過程引入了分析目標譜（analytical target profile，ATP）、關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQA）、實驗設計（design of experiment，DOE）、設計空間（design space，DS）等概念［3-4］，使傳統的HPLC開發過程更加科學。引入QbD后的HPLC開發流程見圖1。

圖1　基于QbD的HPLC方法開發流程

下面就各個流程模塊逐一進行論述。

1　建立分析目標譜

分析目標譜用來定義分離目標物所需要的HPLC方法選擇、設計以及開發活動的范圍。首先，需要確定分析目標物，然后通過文獻檢索獲得分離目標物或結構類似物已有的HPLC色譜條件，也可以通過專家系統或個人經驗預測可能的色譜條件，還可以通過試錯法或實驗設計（Plackett-Burman法）［5］初步得出可能的色譜條件及相應的參數范圍。例如，對于含量測定，重點關注專屬性試驗中強降解試驗中結構相似雜質與目標物的分離情況，以及方法的耐用性；對于原料藥的有關物質測定，要充分考慮起始物料、中間體以及降解產物的類型，重點考察有關物質的分離度及方法的靈敏度。

可以通過列表的方法來描述分析目標譜，列出目標分析物的名稱及結構式、需要達到的分離度、可能的色譜條件（流動相組成、色譜柱類型及尺寸、檢測器類型、柱溫、流速以及進樣量等）、樣品處理方法及穩定性、期望達到的色譜指標（如分離度、精密度、檢測限、回收率）等。

2　風險分析

風險分析是對分析目標譜的評估過程，旨在確定影響HPLC分析結果的關鍵質量參數和屬性。常用的風險評估工具有失效模式和效果分析（FMEA）、危害分析和臨界點控制點（HACCP）［6］等。下面以FMEA為例說明如何進行風險分析。

首先，根據風險的嚴重性和發生的可能性對分析目標譜中的每一個因素進行評估，以進行有關物質檢查時分離度差為例子，見表1；風險的嚴重性可以考慮以下3個方面的因素：是否符合《藥品生產質量管理規范》（GMP）要求、是否影響產品質量判斷、是否可以檢測。

表1　分離度差的FMEA風險評估

之后，根據風險的嚴重性（S值，范圍1～10分）和發生的可能性（O值，范圍1～ 10分），可以得出每個因素的風險優先指數 （risk priority index，RPN）。當 1＜ RPN＜ 10，可以接受風險（低風險）；當 11＜ RPN＜ 25，應根據成本/效益比來評估風險（中等風險）；當RPN＞ 25時，不可以接受該風險（高風險）。表1中各種導致有關物質分離度差原因的RPN結果見表2。

表2　分離度差原因的RPN結果

3　設定關鍵質量屬性

依據風險分析結果，把風險程度高的因素列入關鍵質量屬性，重點進行控制。一般來說，色譜柱、流動相組成和pH是各種HPLC方法的關鍵質量屬性。針對不同的分離目標，關鍵質量屬性也有所不同，如進行手性拆分光學異構體時，各光學異構體的分離度以及檢測限也是關鍵質量屬性。

4　實驗設計

實驗設計是QbD的精髓所在，徹底改變了傳統途徑事后評價的做法。針對關鍵質量屬性，按照實驗設計原理，通過一系列的實驗來獲得和證明關鍵質量屬性的范圍。常用的實驗設計方法是響應面分析，表3總結了目前文獻中響應面分析所用的模式及色譜參數（通常就是關鍵質量屬性）。

表3　文獻中響應面分析的模式及色譜參數

5　設計空間

通過實驗設計，可以得到HPLC關鍵質量屬性的范圍，比如說，當有機相比例或者pH值在某個范圍時，目標分析物的分離度大于 1.5，滿足HPLC分析的基本要求，這個范圍就是方法的設計空間，據此可以定義方法的系統適用性的要求。這種方式改變了系統適用性要求憑經驗制訂的做法。

6　方法學驗證

通過上述步驟，獲得了色譜條件和設計空間，根據相關指南的要求，如《中國藥典》附錄［12］等，就可以進行分析方法學的驗證。耐用性作為分析方法學驗證中的重要參數，也可以通過實驗設計的方法來確認，如果分析方法最后制訂的操作范圍和上述設計空間一致，可以考慮直接引用實驗設計的結果，減少不必要的工作量。

7　日常分析

通過分析方法驗證，如果需要在另一個分析實驗室使用本方法，必須進行分析方法轉移，進行轉移時可以考慮上述關鍵質量屬性和設計空間的結果，確保有效、可靠的轉移。日常分析過程中，應注意記錄OOS（out of specification）結果以及相關的偏差，為進一步評估分析方法的適用性積累數據。

8　持續改進

通過積累的數據，如果出現新的工藝過程中的雜質或者長期穩定性研究中降解產物，導致分析方法不適用時，可以回到分析方法開發的最初階段，重新優化分析方法，按QbD流程建立新的分析方法，并進行相應的變更，實現分析方法基于方法生命周期的管理。

基于質量源于設計的方法建立HPLC分析方法打破了過去純粹依靠經驗的做法，使開發過程更加科學、合理。隨著計算機及人工智能的發展，逐漸有公司開發了可以輔助進行HPLC方法開發的軟件，如Drylab、Fusion、ChromSword、ACD/AutoChrom Method Development Suite、ACD/LC simulator、LC Method Developer等，已經有論文借助這些軟件［13-20］，依據QbD理念建立HPLC方法，相信隨著這些軟件的普及以及QbD理念的深入人心，HPLC方法的開發過程一定會更加規范。

參考文獻：

［1］ICH.ICH harmonized tripartite guideline：pharmaceutical development，Q8（R2）［S］.（2009-08）［2016-03-01］.http：//www.ich.org/ fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q8_ R1/Step4/Q8_R2_Guideline.pdf.

［2］ Snyder LR，Kirkland JJ，Glajch JL.Practical HPLC method development，second edition［M］.New York：John Wiley&Sons，Inc.，1997：2.

［3］ Peraman R，Bhadraya K，Padmanabha Reddy Y.Analytical quality by design：a tool for regulatory flexibility and robust analytics［J］.Int J Anal Chem，2015：1-9.doi：10.1155/2015/868727.

［4］ Raman N，Mallu UR，Bapatu HR.Analytical quality by design approach to test method development and validation in drug substance manufacturing［J］.J Chem，2015.doi：10.1155/2015/ 435129.

［5］沈熊，陸繼偉，梁健，等.應用質量源于設計的理念優化大鼠血漿中大黃蒽醌的分析方法［J］.色譜，2013，31（6）：561-566.

［6］ ICH.ICH harmonized tripartite guideline：Quality Risk Management（Q9）［S］.（2005-11-09）［2016-03-01］.http：//www.ich.org/ fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q9/ Step4/Q9_Guideline.pdf.

［7］ Shah AD，Patel CN.Implementation of QbD approach to the RP-HPLC method development and validation of roflumilast in bulk and tablet dosage form：an application in degradation study ［J］.World J Pharm Pharm Sci，2014，3（6）：2281-2307.

［8］ Safa F，Hadjmohammadi MR.Simultaneous optimization of the resolution and analysis time in micellar liquid chromatography of phenyl thiohydantoin amino acids using Derringer’s desirability function［J］.J Chromatogr A，2005，1078（1）：42-50.

［9］Boussès C，Ferey L，Vedrines E，et al.Using an innovative combination of quality-by-design and green analytical chemistry approaches for the development of a stability indicating UHPLC method in pharmaceutical products［J］.J Pharm Biomed Anal，2015，115：114-122.doi：10.1016/j.jpba.2015.07.003.

［10］ Awotwe-Otoo D，Agarabi C，Faustino P J，et al.Application of quality by design elements for the development and optimiza-tion of an analytical method for protamine sulfate［J］.J Pharm Biomed Anal，2012，62：61-67.doi：10.1016/j.jpba.2012.01.002.

［11］李濤，胡昌勤，畢開順.洛伐他汀有關物質HPLC分析方法的優化［J］.藥物分析雜志，2011，31（9）：1707-1714.

［12］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版）四部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：374.

［13］ Schmidt AH，Molnár I.Using an innovative Quality-by-Design approach for development of a stability indicating UHPLC method for ebastine in the API and pharmaceutical formulations［J］.J Pharm Biomed Anal，2013，78-79（9）：65-74.

［14］ Molnar I.Computerized design of separation strategies by reversed-phase liquid chromatography：development of DryLab software［J］.J Chromatogr A，2002，965（1-2）：175-194.

［15］Hanafi R，Mosad S，Abouzid K，et al.Baclofen ester and carbamate prodrug candidates：a simultaneous chromatographic assay，resolution optimized with DryLab［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，56（3）：569-576.

［16］ Karmarkar S，Garber R，Genchanok Y，et al.Quality by design （QbD）based development of a stability indicating HPLC method for drug and impurities［J］.J Chromatogr Sci，2011，49 （6）：439-446.

［17］ Hewitt EF，Lukulay P，Galushko S.Implementation of a rapid and automated high performance liquid chromatography method development strategy for pharmaceutical drug candidates［J］.J Chromatogr A，2006，1107（1-2）：79-87.

［18］Xiao KP，Xiong Y，Liu FZ，et al.Efficient method development strategy for challenging separation of pharmaceutical molecules using advanced chromatographic technologies［J］.J Chromatogr A，2007，1163（1-2）：145-156.

［19］ Stafford JD，Maloney TD，Myers DP，et al.A systematic approach to development of liquid chromatographic impurity methods for pharmaceutical analysis［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，56（2）：280-292.

［20］ T？rnblom JK，Bureyko TFW，Mackinnon CD.Simulating phenol high-performance liquid chromatography retention times as the pH changes：Mobile phase pH versus buffer pH［J］.J Chromatogr A，2005，1095（1-2）：68-73.

◆醫藥快訊◆

Ertugliflozin用于 2型糖尿病的 2項Ⅲ期臨床試驗達首要終末指標

默克（Merck）公司和輝瑞（Pfizer）公司于2016 年6月11日宣布，其在研藥物Ertugliflozin用于2型糖尿病的2項Ⅲ期臨床試驗達首要終末指標。

本2項試驗（VERTIS Mono和VERTIS Factorial）為Ertugliflozin的VERTIS臨床試驗項目中的2項，該項目結果已于2016年第76屆糖尿病協會（ADA）科學年會上公布。

VERTIS Mono為隨機、雙盲、安慰劑對照試驗，受試者按1∶1∶1的比例隨機分入Ertugliflozin 5 mg組、Ertugliflozin 15 mg組及安慰劑組。試驗的首要終末指標為26周時血糖控制改善，次要終末指標之一為糖化血紅蛋白（HbA1c）低于7.0%。試驗結果顯示，Ertugliflozin組與安慰劑組相比，HbA1c顯著降低，達首要終末指標。Ertugliflozin組HbA1c低于7.0%的受試者比例顯著高于安慰劑組。各組間不良事件發生率相似。

VERTIS Factorial為隨機、雙盲試驗，受試者按1∶1∶1∶1∶1的比例隨機分入Ertugliflozin 5 mg+西格列汀組、Ertugliflozin 15 mg+西格列汀組、Ertugliflozin 5mg組、Ertugliflozin 15 mg組及西格列汀組。試驗的首要終末指標為26周時血糖控制改善，次要終末指標之一為 HbA1c低于 7.0%。試驗結果顯示，Ertugliflozin與西格列汀合用與兩藥單用相比，HbA1c顯著降低，達首要終末指標。Ertugliflozin與西格列汀合用HbA1c低于7.0%的的受試者比例顯著高于兩藥單用。各組間不良事件發生率相似。

（來源：http://www.drugs.com）

doi：10.3969/j.issn.1672-5433.2016.08.008

收稿日期：（2016-03-28）

作者簡介：楊家愛，女，主管藥師。研究方向：醫院藥學。E-mail：abbie387@sohu.com曹天海，男，工程師。研究方向：新藥開發。通訊作者E-mail：skyrin_jida@126.com

Development of HPLC Method Based on Quality by Design

Yang Jiaai1，Cao Tianhai2（1 Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， YunnanKunming650032， China；2InternationalGMPCertificationDepartment， KunmingJida Pharmaceutical Co.，Ltd.，650106）

ABSTRACTThe application of quality by design is steering from the process development to the pharmaceutical analysis.HPLC is an important tool in the pharmaceutical analysis，of which the scientificalness and normalization of development should be paid more attention.This paper reviews the application of quality by design in the development of HPLC method.

KEY WORDSQuality by Design；HPLC；Review