HPLC法快速測定生脈注射液指紋圖譜*

趙炳祥　董　禮［華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625000］

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HPLC法快速測定生脈注射液指紋圖譜*

趙炳祥董禮△
［華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625000］

目的采用小粒徑色譜柱和HPLC法，建立生脈注射液指紋圖譜快速測定方法。方法 色譜柱采用Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）；流動相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為2 mL/min；檢測波長為203 nm；柱溫為30℃；進樣量為4 μL。檢測10批生脈注射液，并建立對照指紋圖譜。以指紋圖譜輪廓計算快速法對照指紋圖譜與法定對照指紋圖譜相似度。結果 快速法對照指紋圖譜與法定對照指紋圖譜相似度為0.944。結論快速測定法色譜輪廓與法定標準法一致。該方法檢測快速、準確、可靠，可取代法定標準中指紋圖譜檢測法。

指紋圖譜生脈注射液快速測定相似度

【Abstract】Objective：To establish a rapid detection of the fingerprint of Shengmai injection with small diameter column and HPLC method.Method：The analysis was performed on a Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）.Mobile phase was acetonitrile-water with gradient elution；flow rate was 2.0mL/min；detection wavelength at 203 nm；column was 30℃，and injection volume was 4 μL.Then it conducted a new standard fingerprint by ten batches of Shengmai injection detection with the new method，and rapid method for calculating contour of fingerprints were compared between new standard fingerprint and legal standard fingerprint with profile data to find out the similarity.Result：The similarity between rapid standard fingerprint and legal standard fingerprint was 0.944.Conclusion：The chromatographic profile of the new method IS consistent with the legal standard chromatographic profile.And it is rapid，accurate and stable，which can replace the detection method of fingerprint in legal standard.

【Key words】Fingerprint；Shengmai injection；Rapid detection；Similarity

生脈注射液為華西醫科大學藥學院根據我國古驗方“生脈散”研制而成的中藥注射劑，由紅參、麥冬、五味子3味藥組成［1］。廣泛應用于心腦血管疾病（如心力衰竭、低血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛、心律失常、心肌梗死、腦梗死等）的治療，并取得了良好的治療效果［2-4］。2011年10月25日，由國家藥典委員會審定，國家食品藥品監督管理局頒布正式執行生脈注射液新質量標準［5］。該標準在原標準的基礎上增加了指紋圖譜相似度評價，對生脈注射液的質量穩定性、有效性控制起著十分重要的作用。近年來，隨著超高效（快速）液相色譜（UPLC、UHPLC）的應用，小粒徑色譜迅速進入了色譜分析領域。超高效液相色譜能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，適用于微量復雜混合物的分離和高通量研究［6］。但是超高效（快速）液相色譜系統的價格昂貴、市場占有率較低、企業配置UPLC或UHPLC較少。因此，利用HPLC分析系統，結合小粒徑色譜柱，建立快速、準確的生脈注射液指紋圖譜分析方法，是本文研究的主要目的。

1　材料與方法

1.1儀器與材料Agilent 1260高效液相色譜儀 （安捷倫科技有限公司，泵模塊型號：G1311B），METTLER TOLEDO XA205DU型電子天平 （梅特勒-托利多稱重設備系統有限公司）。乙腈（色譜純，Merk）；超純水；人參皂苷Rg1（批號 110703-200726）、Re（批號110754-200822）、Rb1（批號110704-200420）、五味子醇甲（批號110857-201010）購于中國食品藥品檢定研究院。生脈注射液由雅安三九藥業有限公司生產。

1.2色譜條件采用Waters X-BridgeTMBEH ShieldRP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）色譜柱；乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～6min，0%A→10%A；6～8 min，10%A→23%A；8～10 min，23%A→23%A；10～17 min，23%A→60%A；17～19 min，60%A→100%A）；流速2 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫：30℃；進樣量4 μL［7］。

1.3參照物溶液的制備取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、五味子醇甲適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含0.10 mg、0.08 mg、0.20 mg和0.02 mg的混合溶液，即得［5］。

1.4供試品溶液的制備取生脈注射液適量，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.5精密度試驗取同1份供試品溶液，按“1.2”項下條件連續進樣6次，測定特征峰（17個）相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

1.6重復性試驗取同一批樣品6份，按“1.2”項下條件分別進樣，測得其特征峰（17個）峰面積相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3.5%，表明重復性良好。

1.7穩定性試驗取同一份供試品溶液，按“1.2”項下條件分別在0、2、4、8、12、24 h進行測定，其特征峰（17個）峰面積相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3.5%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

1.8耐用性試驗取同一份供試品溶液，按“1.2”項下條件在另外2臺Agilent 1260高效液相色譜儀中進樣，記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2.0版）”軟件計算相似度，3個色譜圖相似度（17個特征峰匹配）為1.00，表明該方法儀器間使用耐用性良好。

2　結　果

2.1對照指紋圖譜的建立見圖2。按“1.2”項色譜方法，檢測10批生脈注射液供試品，記錄色譜圖，見圖1；選擇穩定性好、吸收強、特征明顯的色譜峰為共有峰，共選定17個峰。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2.0版）”軟件，以特征峰匹配，建立對照指紋圖譜。

圖1　快速法生脈注射液指紋圖譜

圖2　快速法生脈注射液　對照指紋圖譜

2.2相似度評價對比新建對照指紋圖譜和法定對照指紋圖譜（圖3），兩者色譜圖出峰相似；但二者色譜圖相似度具體多少，需要進一步進行評價。本研究以標準圖譜輪廓數據點相似度進行評價。

2.3指紋圖譜輪廓預處理將新建對照指紋圖譜輪廓所有數據點乘以5，保存輪廓數據。導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2.0版）”軟件，與法定對照圖譜進行特征峰匹配（17特征峰），見圖4。將匹配后的新建對照圖譜和法定對照圖譜數據導出，得到匹配后的數據點。進一步刪除多余數據點，最終得到5200組信號數據。

圖3　　生脈注射液法定對照指紋圖譜

圖4　　數據點匹配后的　對照指紋圖譜

2.4對照圖譜相似度計算對2.3處理后的圖譜數據，利用夾角余弦法［8］計算新對照指紋圖譜和法定對照指紋圖譜的相似度，結果相似度為0.944，說明快速指紋圖譜法所測指紋圖譜與法定標準法所測指紋圖譜相似度高，可以取代法定標準法。

3　討　論

利用HPLC研究生脈注射液指紋圖譜，分析時間較長，大約100 min［9-10］；而利用超高效液相色譜（UPLC）建立生脈注射液指紋圖譜，分析時間約25～40 min［11-12］；本研究建立的指紋圖譜分析方法為19 min，大大提高了分析效率。已報道采用 Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6×100 mm，2.5 μm）色譜柱，建立了參麥注射液指紋圖譜快速測定法，利用峰面積相似度評價快速指紋圖譜法與法定方法檢測結果的一致性［7］。本研究以生脈注射液為研究對象，建立生脈注射液的快速測定法，并利用輪廓相似度評價色譜圖的一致性，結果發現快速指紋圖譜法所測指紋圖譜輪廓與法定標準法輪廓基本一致。生脈注射液指紋圖譜色譜圖輪廓，能全面反映色譜圖的所有信息，保持了中藥多成分信息的完整性［13-15］；以色譜圖輪廓信息進行相似度計算，相對于特征峰面積相似度計算，更能反應快速分析方法與法定分析方法的一致性。

生脈注射液指紋圖譜快速分析法，分析速度快、結果穩定、與法定方法結果一致，可取代法定標準指紋圖譜檢測方法。

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Rapid Detection of Fingerprint of Shengmai Injection by HPLC

ZHAO Bingxiang，DONG Li.China Re-sources Sanjiu（Ya′an）Pharmaceutical Co.，Ltd.，Sichuan，Ya′an 625000，China.

R91文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-0965-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.007

國家重大新藥創制科技重大專項（2009ZX09502-030）

△（電子郵箱：dongli@ya999.com）

（2015-12-20）