黃芪預處理對大鼠腸系膜缺血再灌注損傷后氧化應激和炎癥反應的抑制作用*

裴志萍　牛文革　柴靜波　孟　潔（河北省邯鄲市第二醫院，河北 邯鄲 056001）

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黃芪預處理對大鼠腸系膜缺血再灌注損傷后氧化應激和炎癥反應的抑制作用*

裴志萍△牛文革柴靜波孟潔
（河北省邯鄲市第二醫院，河北 邯鄲 056001）

目的 研究黃芪預處理對大鼠腸系膜缺血再灌注損傷后氧化應激和炎癥反應的抑制作用。方法 取120只實驗用大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、銀杏葉提取物（3.15 mg/kg）預處理組和黃芪（5、10、20 g/kg）預處理組；術前7 d開始腹腔注射給藥（每日1次）。通過夾閉腸系膜上動脈后去夾恢復血流再灌注的方法制備腸系膜缺血再灌注損傷大鼠模型；再灌注2 h后，測定腸組織含水量，HE染色觀察腸組織病理變化并進行損傷評分（Chiu′s氏評分）；檢測腸組織中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、GSH-Px、過氧化氫酶（CAT）］活性和丙二醛（MDA）含量；測定血清中總抗氧化能力（T-AOC）水平和一氧化氮（NO）含量；酶聯免疫法（ELISA）測定腸組織中炎癥細胞因子（CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）和內毒素水平。結果 與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預處理組大鼠腸組織含水量顯著降低（P<0.05或P<0.01）；黃芪預處理組大鼠腸系膜病變較模型組均明顯改善，其中黃芪（10、20 g/kg）預處理組Chiu′s氏評分顯著降低（P<0.05或P<0.01）；黃芪（10、20 g/kg）預處理組腸組織中SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），血清中NO、CRP、TNF-α、IL-6含量和內毒素水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）；其中黃芪（20 g/kg）預處理組腸組織中GSH-Px活性和血清中T-AOC含量顯著升高（P<0.05），血清中cGMP、IL-10含量顯著升高且IL-1β含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論 黃芪預處理具有抑制大鼠腸系膜缺血再灌注損傷后氧化應激和炎癥反應的作用，從而對腸系膜缺血再灌注損傷起到保護作用。

腸系膜缺血再灌注黃芪預處理氧化應激炎癥反應

【Abstract】Objective：To investigate the inhibition of Astragalus pretreatment on oxidative stress and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion rats.Methods：120 expremental rats were randomly devided into sham operation group，the model group，Ginkgo biloba extract（GB，3.15 kg）pretreatment group and Astragalus（5，10，20 g/kg）pretreatment groups.Severn days before surgery，the drugs were given by intraperitoneal injection，once a day.The rat models were made by clipping superior mesenteric artery；two hours later，the water content was detected；the histopathological changes of intestinal tissue was observed by HE staining and the Chiu′s score was detected；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in intestinal tissue were detected；the level of T-AOC and the content of NO，cGMP in serum were detected；the level of CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10 and endotoxin in intestinal tissue were detected.Results：Compared with the model group，the water content in Astragalus（10，20 g/kg）pretreatement groups were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）；the histopathological changes of intestinal tissue in Astragalus pretreatement groups were significantly improved，the Chiu′s score in Astragalus（10，20 g/kg）pretreatement groups were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01），the activity of SOD，CAT in intestinal tissue were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased（P< 0.05 or P<0.01），the level of NO，CRP，TNF-α，IL-6 and endotoxin in intestinal tissue of Astragalus（10，20 g/kg）pretreatement groups were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）；the activity of GSH-Px and the level of T-AOC in intestinal tissue were significantly increased（P<0.05），the content of cGMP and the level of IL-10 inserum were significantly increased（P<0.05 or P<0.01），IL-1β was significantly decreased（P<0.01）.Conclusion：Astragalus pretreatment has inhibitive effects on oxidative stress and inflammation in intestinal ischemiareperfusion rats，which exhibits protective effect on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.

【Key words】Intestinal ischemia-reperfusion；Astragalus；Pretreatment；Oxidative stress；Inflammation

黃芪為為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，始載于《神農本草經》，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效，為常用中藥之一。現代藥理學研究發現，黃芪預處理能夠抑制氧化應激損傷、降低炎癥反應而表現出對腦組織和心肌組織缺血再灌注損傷的保護作用［1-2］，但對腸系膜缺血再灌注損傷是否具有保護作用，仍未見文獻報道。本實驗采用黃芪預處理7 d后，通過夾閉腸系膜上動脈45 min后去夾恢復血流再灌注的方法制備的腸系膜缺血再灌注大鼠模型，研究黃芪預處理對大鼠腸系膜缺血再灌注損傷的保護作用并探討其可能的作用機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑

黃芪注射液（成都地奧九泓制藥廠生產，規格為20 g/10 mL，批號為20141209）；銀杏葉提取物（神威藥業集團有限公司生產，規格為17.5 g/5 mL，批號為140725）；HE試劑盒試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；一氧化氮（NO）、環鳥苷酸（cGMP）、C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β （IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和內毒素酶聯免疫法（ELISA）檢測試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；血清中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、GSH-Px、過氧化氫酶（CAT）活性測定試劑盒和丙二醛（MDA）含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠，8周齡，體質量180～220 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。

1.3實驗儀器

UV759型紫外-可見分光光度計 （上海圣科儀器設備有限公司）；F50型酶標儀 （瑞士TECAN公司）；CUT4062型石蠟切片機（德國SLEE公司）；IX71型倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4分組與給藥

將120只實驗用大鼠隨機分為假手術組、模型組、銀杏葉提取物（3.15 mg/kg）預處理組和黃芪（5、10和20 g/kg）預處理組；各預處理組于術前7 d開始腹腔注射給藥，每日1次，其中假手術組和模型組分別給予等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.5模型制備

腸系膜缺血再灌注大鼠模型的制備：術前12 h禁食，麻醉后仰位固定，開腹并暴露腸系膜上動脈，用無創動脈夾夾閉45 min后去夾恢復血流再灌注，制備腸系膜缺血再灌注大鼠模型［3］。

1.6標本采集與檢測

再灌注2 h后，取材并進行各指標的檢測。

1.6.1腸組織含水量的測定腹腔注射烏拉坦實施麻醉后，開腹取回盲部10 cm以上的相同部位4 cm的腸管，用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈后，秤量濕質量（W1）；然后將該腸段置于107℃烘烤72 h后稱干質量（W2），計算腸組織含水量：含水量（%）=［（W1-W2）/W1］×100%。

1.6.2腸組織病理性形態學變化的觀察及Chiu′s氏評分參照1.6.1方法取各組大鼠腸管，用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，置于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片和展片處理后，行常規HE染色，然后通過光學顯微鏡觀察各組大鼠腸組織病理性形態學變化；參照Chiu等［4］報道的評分標準（Chiu′s氏6級評分標準）進行腸組織損傷評分，0分：結構正常。1分：腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬。2分：絨毛尖端上皮抬高與固有層剝離。3分：絨毛兩側上皮成塊脫落。4分：上皮完全脫落，僅存固有層結構。5分：黏膜固有層崩解、出血和潰瘍。

1.6.3腸組織中抗氧化酶活性及MDA含量的測定

參照“1.6.1”項下方法取回盲部10 cm以上的相同部位腸管，沖洗干凈，加入適量冷裂解液后進行研磨勻漿，經3000 r/min離心10min后取上清液，然后按照各試劑盒操作方法步驟進行處理，通過紫外-可見分光光度計測定各組大鼠腸組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和MDA含量。

1.6.4血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量的測定于“1.6.3”項取腸組織前，通過腹主動脈取血并離心取血清，根據各試劑盒操作方法步驟進行處理，然后通過紫外-可見分光光度計測定各組大鼠血清中T-AOC水平，通過酶標儀測定各組大鼠血清中NO、cGMP含量。

1.6.5腸組織中炎癥細胞因子含量和內毒素水平的測定取“1.6.3”項下所制備的腸組織勻漿上清液，按照ELISA試劑盒操作步驟逐步進行處理，然后通過酶標儀平行測定各組大鼠腸組織中炎癥細胞因子（CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）含量和內毒素水平。

1.7統計學處理

2　結　果

2.1各組大鼠腸組織含水量比較

見表1。模型組大鼠腸組織含水量較假手術組顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預處理組大鼠腸組織含水量顯著降低 （P<0.05或P< 0.01）。

表1　各組大鼠腸組織含水量和Chiu′s氏評分比較（分，±s）

表1　各組大鼠腸組織含水量和Chiu′s氏評分比較（分，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　Chiu′s氏評分（分）假手術組　10　0.32±0.15模型組　10　4.18±0.63**黃芪（5 g/kg）預處理組　10　3.79±0.82含水量（%）72.75±4.13 84.31±5.04**83.59±5.15黃芪（10 g/kg）預處理組　10　2.86±0.64△79.46±4.83△黃芪（20 g/kg）預處理組　10　76.12±4.50△△　2.07±0.49△△銀杏葉提取物預處理組　10　78.35±3.87△　2.53±0.57△

2.2各組大鼠腸系膜病理性形態學變化及損傷評分（Chiu′s氏評分）比較

見表1。觀察病理切片發現：假手術組大鼠腸絨毛完整、排列整齊，未見病理性形態學變化；模型組大鼠腸組織呈現明顯的病理性形態學變化：黏膜上皮細胞脫落，絨毛尖端上皮抬高與固有層分離，中性粒細胞浸潤等；與模型組比較，黃芪預處理組大鼠腸組織病理性形態學變化明顯較輕，其中以黃芪（20 g/kg）預處理組效果最為顯著，見圖1。各組大鼠腸組織損傷Chiu′s氏評分結果：模型組大鼠腸組織Chiu′s氏評分較假手術組顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預處理組大鼠Chiu′s氏評分顯著降低 （P< 0.05或P<0.01）。

圖1　各組大鼠腸系膜病理性形態學變化（HE染色，×200）

2.3各組大鼠腸組織中抗氧化酶活性活性和MDA含量比較

見表2。模型組大鼠腸組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性較假手術組顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預處理組大鼠SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低 （P<0.05或P<0.01），其中20 g/kg預處理組GSH-Px活性顯著升高（P<0.05）。

表2　各組大鼠腸組織中抗氧化酶活性活性和MDA含量比較（±s）

表2　各組大鼠腸組織中抗氧化酶活性活性和MDA含量比較（±s）

組別　n假手術組　10模型組　10黃芪（5 g/kg）預處理組　10 CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）26.91±5.04　5.48±1.29 14.65±4.17**　17.52±3.01**16.49±3.83　14.86±2.75黃芪（10 g/kg）預處理組　10　42.60±5.29△　3.65±1.32　20.68±4.01△　11.27±2.38△△黃芪（20 g/kg）預處理組　10　55.07±6.43△△　4.12±1.57△　25.27±5.24△△　8.15±1.73△銀杏葉提取物預處理組　10　46.23±5.99△　3.79±1.43　21.08±3.62△　7.40±1.89△△SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）68.49±7.06　4.72±1.36 35.02±4.87**　3.08±1.24*38.35±5.71　3.26±1.39

2.4各組大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量比較

見表3。模型組大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量較假手術組均顯著降低 （P<0.05或P< 0.01）；與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預處理組大鼠血清中NO含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），其中20 g/kg預處理組T-AOC水平和cGMP含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表3　各組大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量比較（±s）

表3　各組大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量比較（±s）

組別　n假手術組　10模型組　10黃芪（5 g/kg）預處理組　10 cGMP（pmol/mL）10.51±0.94 7.37±1.22*7.89±1.48黃芪（10 g/kg）預處理組　10　9.98±2.46　12.55±2.48△　8.63±1.02黃芪（20 g/kg）預處理組　10　11.73±3.35△15.03±3.17△△　9.27±1.69△銀杏葉提取物預處理組　10　9.82±2.58△11.84±1.92△　8.24±1.13 T-AOC（U/L） NO（ng/mL）17.59±3.83　19.73±2.26 8.31±2.15**　8.54±1.41**9.07±2.68　10.06±1.72

2.5各組大鼠腸組織中炎癥細胞因子含量和內毒素水平比較

見表4。模型組大鼠腸組織中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和內毒素水平較假手術組顯著升高，IL-10含量顯著降低 （P<0.01）；而與模型組比較，黃芪（10、20 g/kg）預處理組大鼠腸組織中CRP、TNF-α、IL-6含量和內毒素水平顯著降低，其中20 g/kg預處理組IL-1β含量顯著降低且IL-10含量顯著升高 （P<0.05 或P<0.01）。

3　討　論

腸系膜缺血再灌注損傷病理機制非常復雜，病理機制尚不明確。近年來，有研究發現，氧化應激損傷、炎癥反應可能是其重要發病機制之一［5-6］，這也為我們今后研發抑制腸系膜缺血再灌注損傷的新型藥物提供了新的思路。

表4　各組大鼠腸組織中炎癥細胞因子含量和內毒素水平比較（±s）

表4　各組大鼠腸組織中炎癥細胞因子含量和內毒素水平比較（±s）

組別　n假手術組　10模型組　10黃芪（5 g/kg）預處理組　10 IL-10（ng/g）　　內毒素（kEu/g）10.43±1.52　0.13±0.04 52.06±7.39**　1.02±0.19**58.27±6.84　0.92±0.25黃芪（10 g/kg）預處理組　10　137.03±20.75△　32.91±3.78△　77.58±8.13　148.24±35.71△△　62.86±8.35　0.74±0.16△黃芪（20 g/kg）預處理組　10　102.40±17.52△△20.53±3.14△△　62.41±7.09△△　106.50±31.43△△　67.03±9.52△　0.58±0.14△△銀杏葉提取物預處理組　10　132.35±21.37△　34.15±4.01△　80.86±9.30　154.29±40.15△　59.35±7.24　0.83±0.20 CRP（mg/g）　TNF-α（ng/g）42.73±5.06　9.46±1.81 192.51±24.59**　47.20±6.34**164.82±27.48　41.59±5.72 IL-1β（ng/g）45.30±6.24 91.46±11.32**84.01±10.22 IL-6（ng/g）56.38±7.11 205.94±34.56**177.57±42.82

體內氧自由基過剩是導致氧化應激損傷的病理基礎，正常生理狀態下，體內生成的氧自由基能夠在SOD作用下還原生成H2O2，并在CAT催化作用下進一步被還原生成對人體無害的H2O和O2［7-8］；脂質過氧化終產物MDA含量也能夠間接反應腸系膜細胞氧化損傷程度。體內NO是一種信號分子，能夠通過激活可溶性腺苷酸環化酶、升高細胞內cCMP含量而發揮刺激血管舒張、促進血液循環的生理作用［9-10］。此外，NO還具有降低血管反應性，維持腸黏膜的灌注，消除氧自由基、抑制脂質過氧化，改善微循的作用［11］。細胞炎性因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6是臨床上用來監測體內炎癥反應的常用指標；而IL-10是一種多功能負性調節因子，能夠發揮下調炎癥反應，拮抗炎性介質的作用；內毒素是一種對人體具有毒性作用的脂多糖，可引起發熱、微循環障礙、內毒素休克等。

本實驗發現，黃芪預處理能夠有效降低腸組織含水量，改善腸系膜組織病變、降低Chiu′s氏評分，改善腸組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性并降低MDA含量，提高血清中T-AOC水平和NO、cCMP含量，降低腸組織中炎癥細胞因子（CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6）含量及內毒素水平、提高IL-10含量［12-15］；提示黃芪預處理對腸系膜缺血再灌注損傷大鼠氧化應激和炎癥反應具有抑制作用，從而表現出對腸系膜缺血再灌注損傷大鼠的保護作用。

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Inhibition of Astragalus Pretreatment on Oxidative Stress and Inflammation in Intestinal ischemia-reperfusion Rats

PEI Zhiping，NIU Wenge，CHAI Jingbo，et al. The Seond Hospital of Handan，Hebei，Handan 056001，China.

R285.5文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-0967-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.007

河北省自然科學基金資助項目（08B033）

△（電子郵箱：zhjkpqq@163.com）

（2015-11-17）