清肺理痰方對(duì)急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB 和Toll樣受體4表達(dá)的影響*

王　凱　潘俊輝　王　鵬（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

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清肺理痰方對(duì)急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB 和Toll樣受體4表達(dá)的影響*

王凱潘俊輝△王鵬
（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

目的 研究清肺理痰方對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）大鼠肺組織NF-κB和Toll樣受體4表達(dá)的影響。方法 SD大鼠72只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組，地塞米松組、清肺理痰方低、中、高劑量組，共6組，每組12只。各治療組大鼠按試驗(yàn)劑量給予相應(yīng)濃度的藥液，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，模型組與各治療組大鼠采用氣管內(nèi)每只注射0.2 mL mg/mL的脂多糖溶液復(fù)制急性肺損傷模。24 h后取肺組織進(jìn)行HE染色觀察肺組織病理變化，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清IFN-γ濃度，用Western Blot法和qRT-PCR法測(cè)定大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織呈現(xiàn)明顯的肺組織損傷，血清IFN-γ濃度上升，NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型對(duì)照組比較，清肺理痰方低、中、高劑量組血清IFN-γ濃度下降，NF-κB P65和TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)明顯降低（P<0.01），且中、高劑量組低于低劑量組。結(jié)論 清肺理痰方能改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織的損傷，對(duì)肺組織損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制肺組織NF-κB和TLR4 mRNA表達(dá)有關(guān)。

急性肺損傷清肺理痰方核轉(zhuǎn)錄因子-κBTLR4

【Abstract】Objective：To investigate the role of LPS（lipopolysaccharide）in acute lung injury（ALI）and protective effect of Qingfei Litan（QFLT）decoction.Methods：72 SD male rats were randomly divided into 6 groups：the normal control group，the model group，dexamethasone group and QFLT low-dose，middle-dose，high-dose group，12 rats in each group.The experiment lasted for 7 d.LPS（8 mg/mL）was injected into the trachea of rats to perform ALI model.The normal control group and the model group were given the same volume of physiological saline.After 24 hours，Western Blot and qRT-PCR were used to detect NF-κB andTLR4 mRNA and protein in lung tissue.The pathological manifestation of the lung was observed.Results：Compared with the normal group，the expressions of the levels of IFN-γ，NF-κB p65 and TLR4 mRNA and protein was significantly higher in QFLT group（P<0.01）；compared with the model group，the expressions of the levels of IFN-γ，NF-κB p65 and TLR4 mRNA and protein was significantly lower（P<0.01）.High dose group was lower than that of low dose group.Conclusion：Qingfei Litan decoction can less the injury of lung tissue and has protective effects on rats with ALI induced by LPS.The mechanism is possibly related to the inhibition of the expressions of NF-κB and TLR4 mRNA in injured lung tissues.

【Key words】Acute lung injury；QFLT decoction；NF-κB；Toll-like receptor 4

急性肺損傷（ALI）是肺部的全身炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，炎性介質(zhì)調(diào)控失衡在ALI的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，細(xì)胞因子則構(gòu)成了ALI炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。如何通過(guò)中醫(yī)藥的干預(yù)來(lái)調(diào)控ALI的分子機(jī)制已成為治療ALI的重要研究方向。

清肺理痰方源自國(guó)家中醫(yī)藥管理局 《風(fēng)溫肺熱病中醫(yī)診療方案》［1-2］，在本課題前期的臨床研究中療效顯著［3］，并且本課題組在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中初步探討了其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的蛋白表達(dá)的作用機(jī)制［4］。Toll樣受體4（TLR4）作為脂多糖（LPS）的重要受體［5］，通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響ALI的表達(dá)機(jī)制，在前期研究基礎(chǔ)上，深入研究清肺理痰方對(duì)脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB和TLR4表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確ALI的發(fā)病機(jī)制，為中醫(yī)藥治療ALI提供新的分子治療靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)品系和級(jí)別：SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，72只，200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)為44007200019456、44007200021999，實(shí)驗(yàn)證明編號(hào)為00110197、00114773；專用標(biāo)準(zhǔn)飼料、水喂養(yǎng)。

1.2藥物與試劑

清肺理痰方由青天葵10 g，石膏30 g，瓜蔞皮15 g，黃芩15 g，浙貝母 15 g，魚(yú)腥草20 g，蘆葦莖15 g，北杏仁10 g，桔梗15 g，甘草10 g組成，藥物飲片購(gòu)于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，實(shí)驗(yàn)前由武漢康樂(lè)藥業(yè)有限公司制成中藥浸膏，4℃冰箱備用。地塞米松磷酸鈉注射液（天津金耀集團(tuán)湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：51411032）；脂多糖內(nèi)毒素 （Escherichia coli，055：B5，Sigma公司）；IFN-γ試劑盒（購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：J27013191）。一抗p65，一抗TLR4（生產(chǎn)商：abcam）；大鼠NF-κB、TLR4引物探針序列由廣州萊德?tīng)柹锟萍加邢薰竞铣伞?/p>

1.3儀器

BS224S電子分析天平（感量0.0001g，德國(guó)Sartorius）、KDC-2046低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司，序列號(hào)：3530910449）、超聲儀細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，JY92-IIN）。

1.4分組與給藥

大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組及清肺理痰方低、中、組高劑量組，共6組，每組12只。根據(jù)人與動(dòng)物藥物劑量換算公式［6］，經(jīng)過(guò)提取后對(duì)應(yīng)中藥浸膏每劑36.47 g，每只大鼠所對(duì)應(yīng)的相對(duì)劑量為3.95 g/kg，再結(jié)合本課題前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［4］，低劑量組3.95 g/kg體質(zhì)量，中劑量組7.90 g/kg體質(zhì)量，高劑量組15.80 g/kg體質(zhì)量。第1～7日，清肺理痰方低、中、高劑量組動(dòng)物分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，灌胃體積為12 mL/kg體質(zhì)量，每日1次。第6、7日，地塞米松組動(dòng)物腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液，每日1次，連續(xù)2 d，腹腔注射體積為1mL/kg體質(zhì)量。

1.5模型制備

末次給藥1 h后，制作急性肺損傷模型［7-8］。經(jīng)水合氯醛麻醉后，模型對(duì)照組、地塞米松組和低、中、高劑量組的動(dòng)物分別用注射器經(jīng)氣管注入8 mg/mL的脂多糖溶液，正常對(duì)照組注入等體積0.9%氯化鈉注射液，每只0.2 mL。

1.6標(biāo)本采集與檢測(cè)

造模后24 h，動(dòng)物3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，約0.5 mL至EDTA-K2抗凝真空采血管，約4 mL至普通真空采血管，2500 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝于2個(gè)EP管中，標(biāo)記，-20℃保存，備用，ELISA法測(cè)定其IFN-γ含量。剪取左肺，計(jì)算濕/干重比；分離右肺上葉，用4%中性甲醛固定，待檢，用于病理檢測(cè)及肺組織NF-κB和TLR4 mRNA蛋白表達(dá)檢測(cè)；右肺下葉置于液氮罐中作NF-κB和TLR4 mRNA表達(dá)檢測(cè)。

1.6.1肺組織病理學(xué)觀察右上肺組織用4%中性甲醛固定，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織變化。制作好的H.E染色切片置于光學(xué)顯微鏡下，從低倍到高倍，觀察SD大鼠肺組織有無(wú)肺水腫、肺出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚、小氣道損傷等病理改變。按程度積分總和，作為肺損傷程度積分，評(píng)分方法參照相關(guān)文獻(xiàn)［9］。

1.6.2血清IFN-γ檢測(cè)將以上裝有全血的促凝管靜置1 h，2500 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝到EP管中-20℃凍存待測(cè)。ELISA雙抗體夾心法測(cè)定血清IFN-γ的含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.3Western Blot法檢測(cè)肺組織中NF-κB p65和TLR4蛋白的表達(dá)采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法，使用BeyoECL Plus（P0018）等ECL類試劑來(lái)檢測(cè)肺組織中NF-κB p65和TLR4蛋白的表達(dá)，用FluorChemQ多功能成像和定量分析系統(tǒng)將膠片成像。

1.6.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織中NF-κB p65和TLR4 mRNA的表達(dá)按美國(guó)Invitrogen公司Trizol試劑提取總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。12 μL反應(yīng)體系中，10 mmol/L dNTP 1 μL，隨機(jī)引物1 μL，標(biāo)本RNA 2 μg，混勻后于65℃5 min，快速插入冰水中，離心，冰上加入：5×buffer 4 μL，DTT（100 mmol/L）2 μL，RNAsin（40 U/μL）1 μL，M-MLVRT反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，37℃50 min，70℃15 min，-20℃保存。PCR擴(kuò)增：Sybr green 10 μL，上游引物（5 μmol/L）2 μL，下游引物（5 μmol/L）2 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，擴(kuò)增條件：1）95℃10 s；2）95℃5 s，60℃20 S，40個(gè)循環(huán)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)觀察及肺損傷指數(shù)光鏡觀察：正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)未見(jiàn)水腫液和肺出血。模型對(duì)照組各級(jí)支氣管黏膜上皮細(xì)胞部分變性、脫落，間隔增厚，間隔內(nèi)及肺泡腔明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。地塞米松組見(jiàn)上皮細(xì)胞部分變性、脫落，肺泡間隔輕度增厚，中性粒細(xì)胞明顯浸潤(rùn)。清肺理痰方各組大鼠肺組織病理改變輕于模型組，肺泡間間隔增厚，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，未見(jiàn)肺水腫和肺出血（見(jiàn)圖1）。肺損傷的輕重程度評(píng)分：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肺損傷的評(píng)分明顯升高（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組肺損傷的評(píng)分水平明顯降低 （P< 0.05）。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血清IFN-γ水平、肺損傷指數(shù)比較（±s）

表1　各組大鼠血清IFN-γ水平、肺損傷指數(shù)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01。下同。

藥物劑量（g/kg）IFN-γ（pg/mL）-　0.16±0.07-　0.43±0.14△0.005　0.21±0.13**清肺理痰方低劑量組　8　6.00±1.73*組別　n　　肺損傷指數(shù)（分）正常對(duì)照組　8　1.00±0.00模型對(duì)照組　8　8.00±0.00△地塞米松組　8　4.00±1.73*3.95　0.36±0.10*清肺理痰方中劑量組　8　7.90　0.27±0.05**　5.33±0.58*清肺理痰方高劑量組　8　15.80　0.24±0.11**　4.33±0.58*

圖2各組大鼠肺組織病理光鏡下圖片（HE染色，100倍）

2.2各組血清炎癥因子IFN-γ水平比較見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組炎癥因子IFN-γ的水平明顯升高（P<0.01）。與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組IFN-γ的水平明顯降低（P<0.01），且高劑量組低于中劑量組，中劑量組低于低劑量組。

2.3各組大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組NF-κB p65和TLR4蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.01）。與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組的NF-κB p65和TLR4蛋白表達(dá)均降低，且與劑量呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。

表2　各組大鼠肺組織NF-κB p65/TLR4蛋白IOD值的比較（±s）

表2　各組大鼠肺組織NF-κB p65/TLR4蛋白IOD值的比較（±s）

組別　n　TLR4蛋白IOD值正常對(duì)照組　8　484.10±30.94模型對(duì)照組　8　809.70±121.36△△地塞米松組　8　658.95±96.60**藥物劑量（g/kg） P65蛋白IOD值-　779.33±133.00-　1288.64±115.09△△0.005　892.67±191.11**清肺理痰方低劑量組　8　785.53±92.97*3.95　1109.09±105.86*清肺理痰方中劑量組　8　7.90　1094.03±72.86*　760.83±99.38*清肺理痰方高劑量組　8　15.80　1041.71±123.55*　749.82±49.06*

2.4各組大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4 mRNA表達(dá)比較見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組NF-κB p65和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高 （P< 0.01）。與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和清肺理痰方各組的NF-κB p65和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，且與劑量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05或P<0.01）。

表3　各組急性肺損傷大鼠肺組織P65/TLR4 mRNA的CT值相對(duì)表達(dá)量比較（×10-3，±s）

表3　各組急性肺損傷大鼠肺組織P65/TLR4 mRNA的CT值相對(duì)表達(dá)量比較（×10-3，±s）

與模型組比較，*P＜0.01；與正常對(duì)照組比較，△P＜0.01。

組別　n　TLR4正常對(duì)照組　8　0.83±0.18模型對(duì)照組　8　1.74±.096△地塞米松組　8　1.08±0.11*△藥物劑量（g/kg）　NF-κB p65-　0.76±0.10-　1.72±0.22△0.005　1.03±0.21*△清肺理痰方低劑量組　8　1.42±1.19*△3.95　1.31±0.16*△清肺理痰方中劑量組　8　7.90　1.25±0.11*△　1.24±0.29*△清肺理痰方高劑量組　8　15.80　1.18±0.61*△　1.16±0.14*△

3　討　論

研究表明，LPS信號(hào)通路的表達(dá)是通過(guò)跨膜傳導(dǎo)的“門戶蛋白”TLR4來(lái)實(shí)現(xiàn)的［10-11］，TLR4/NF-κB途徑參與了LPS誘導(dǎo)的 ALI［12-13］，發(fā)現(xiàn)在LPS介導(dǎo)的膿毒癥中NF-κB持續(xù)表達(dá)，和病情的嚴(yán)重程度正相關(guān)，這些都提示 TLR4/NF-κB通路可能是觸發(fā)炎癥反應(yīng)和器官損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。風(fēng)溫肺熱病是風(fēng)溫病與肺熱病的合稱，由風(fēng)熱病毒引起的，而以冬春兩季多發(fā)的急性外感熱病；以發(fā)熱、咳嗽、咯痰、胸悶、舌紅苔白或黃、脈數(shù)為主癥，相當(dāng)于西醫(yī)的急性肺炎等急性肺部感染疾病［14］。本病病因主要為外感火熱毒邪、風(fēng)熱或風(fēng)寒邪氣。其病變部位主要在肺，痰瘀互阻，導(dǎo)致肺臟功能失調(diào)［15］。本方由石膏、青天葵、瓜蔞皮、黃芩等10味中藥組成，具有解肌清熱，除煩止渴的功效，適用于肺熱實(shí)證。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，模型組大鼠肺泡腔內(nèi)充滿炎性滲出物和出血，肺損傷評(píng)分明顯增高，提示造模成功。與正常組相比，模型對(duì)照組NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)探究的機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，從而減少細(xì)胞因子分泌以減輕臟器組織損傷，進(jìn)而發(fā)揮抗炎保護(hù)作用，提示ALI的病理變化與NF-κB p65和TLR4 mRNA表達(dá)的升高有關(guān)。用清肺理痰方灌胃處理大鼠，能使LPS誘導(dǎo)的ALI肺組織水腫、出血等損傷程度明顯減輕。與模型對(duì)照組比較，清肺理痰方各組血清IFN-γ含量下降、肺損傷的輕重程度評(píng)分降低，NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)清肺理痰方各組隨著劑量增加肺損傷程度減低，表明清肺理痰方對(duì)內(nèi)毒素致ALI大鼠有保護(hù)作用。其機(jī)制可能與其能降低內(nèi)毒素致ALI大鼠肺組織NF-κB p65和TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)有關(guān)。

鑒于以上結(jié)果，清肺理痰方對(duì)ALI的大鼠具有一定的保護(hù)作用，為中醫(yī)藥治療臨床ALI提供了研究方向，對(duì)中西醫(yī)結(jié)合治療肺部疾病提供了新思路。

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Ef fect of Qingfei Litan Decoction on NF-κB and TLR4 Expressions in LPS-induced Rats with Acute Lung Injury

WANG Kai，PAN Junhui，WANG Peng. The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong，Guangzhou 510120，China.

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1004-745X（2016）06-1001-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.016

廣東省廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012J4300068）

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（2016-03-01）