白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌生物膜的抑制作用研究*

殷網(wǎng)虎　曹美林　李　佳　鄧　慧（江蘇省鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212003）

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·思路與方法·

白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌生物膜的抑制作用研究*

殷網(wǎng)虎曹美林李佳鄧慧
（江蘇省鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212003）

目的 研究白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌生物膜的影響，為控制臨床感染提供實驗依據(jù)。方法 利用96孔聚苯乙烯板條構(gòu)建生物膜的技術(shù)篩選生物膜形成菌株，并采用微量稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌的MIC50為78.13 μg/mL，MIC90為312.5 μg/mL，SMIC50為312.5 μg/mL，SMIC90為625.0 μg/mL。結(jié)論 白藜蘆醇體外對鮑曼不動桿菌生物膜具有明顯抑制和破壞作用。

鮑曼不動桿菌白藜蘆醇生物膜抑制

【Abstract】Objective：To investigate the effect of Resveratrol on biofilm of Acinetobacter Bauman to provide experimental basis for the control of clinical infection.Methods：Biofilm was selected with biofilm construction tech of 96 hole polystyrene slab to form strains，and Microdilution method was used to detect Minimal inhibitory concentration（MIC）.Results：MIC50 and MIC90 of resveratrol on Acinetobacter Bauman was 78.13 μg/mL and 312.5 μg/mL，respectively；SMIC50 and SMIC90 was 312.5 μg/mL and 625.0ug/ml，respectively.Conclusion：Resveratrol has obvious inhibition and destruction on biofilm of Acinetobacter Bauman.

【Key words】Acinetobacter Bauman；Resveratrol；Biofilm；Inhibit

白藜蘆醇是非黃酮類多酚化合物，1940年由日本學者從毛葉藜蘆的根部分離得到［1］。植物種子如葡萄、花生等含較豐富的白藜蘆醇，研究表明白藜蘆醇具有良好的抑菌活性［2］。美國疾病控制與預(yù)防中心曾估計，65%的人類感染都與細菌生物膜有關(guān)［3］。目前，鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，其生物膜（Biofilrn）作為主要毒力因子，參與鮑曼不動桿菌的粘附、耐藥、應(yīng)對環(huán)境變化、免疫逃逸等多個過程［4］。本研究主要探討中藥有效成分白藜蘆醇體外對鮑曼不動桿菌生物膜的抑制作用，旨在為中藥治療由鮑曼不動桿菌生物膜引起的感染提供實驗指導(dǎo)依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1　材料和方法

1.1菌株來源鮑曼不動桿菌菌株67株，均為二代菌，分離自筆者所在醫(yī)院及鎮(zhèn)江市其他醫(yī)療單位臨床標本，各菌株均經(jīng)DL-96細菌鑒定儀鑒定；大腸埃希氏菌ATCC259223標準菌株（二代菌）購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2試劑儀器M-H（Muller-Hinton）藥敏瓊脂培養(yǎng)基和M-H肉湯干粉培養(yǎng)基，由杭州天和微生物試劑有限公司提供，批號130809。白藜蘆醇（純度大于≥99.5%），由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，批號K1414052。96孔板由江蘇康健醫(yī)療用品有限公司提供，批號20131012。DL-96自動微生物鑒定儀及鑒定卡由珠海市迪爾生物工程有限公司提供。美國熱電FC型酶標儀。

1.3研究方法1）生物膜形成菌株篩選：生物膜篩選方法參照文獻［5-6］適當加以改進。將菌株37℃復(fù)蘇18 h，取無菌96孔板條，每孔加MH肉湯100 μL；制備0.5麥氏菌液，稀釋40倍，取稀釋菌液20 μL/孔加樣（每孔的細菌量為5×104），平行加3孔。留3孔作為空白，同步將大腸埃希氏菌ATCC25922質(zhì)控株作陰性對照。37℃培養(yǎng)24 h，鹽水洗滌3次，倒置晾干后每孔加1 g/L結(jié)晶紫染色20 min，鹽水洗滌3次，每孔加95%乙醇200 μL，混勻溶解，570 nm處酶標儀讀數(shù)。以大腸埃希氏菌為陰性對照，OD值≥陰性對照OD值+ 3SD判斷為產(chǎn)生物膜菌株。2）白藜蘆醇最低抑菌濃度（MIC）測定：MIC定量測定依據(jù)美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）的標準（M27-A）方案結(jié)合文獻［7-8］適當改進。將白藜蘆醇溶于二甲基亞砜，制成濃度為10 mg/mL的藥液避光備用，實驗時用MH肉湯將白藜蘆醇倍比稀釋成終濃度5000～2.44 μg/mL，依次加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每排1～12孔為1個系列濃度。最后1排作質(zhì)控、空白、陽性對照各4孔，其中空白對照只加培養(yǎng)基不加菌液，質(zhì)控對照以大腸埃希氏菌ATCC259223標準菌株作為實驗菌株，空白對照和質(zhì)控對照的其他實驗步驟同臨床菌株，陽性對照則采用一株產(chǎn)生物膜臨床菌株，實驗過程除不加白藜蘆醇溶液外，其他步驟同臨床菌株。取生物膜形成菌株37度18 h復(fù)蘇。取無菌試管2支，每支加入MH液2 mL，第1支加入適量菌落，制備0.5麥氏菌液（菌量為1.5×108/mL），取該菌液10 μL加入第2支試管內(nèi)，稀釋200倍，混勻后取該濃度菌液100 μL/孔加樣，平行加1行（每孔的細菌量約為5×104）。每行1個菌種。混勻后，加蓋37℃培養(yǎng)24 h。以肉眼判斷，無細菌生長的最低藥物濃度孔（孔為透徹清亮者），即為白藜蘆醇對受試菌的MIC。3）白藜蘆醇抑制鮑曼不動桿菌生物膜的最低抑菌濃度（SMIC）測定：取生物膜形成菌株37℃18 h復(fù)蘇，取無菌試管兩支，每支加入MH 液2 mL，第1支加入適量菌落，制備0.5麥氏菌液（菌量為1.5×108/mL），取該菌液10 μL加入第2支試管內(nèi)，稀釋200倍，混勻后取該濃度菌液100 μL/孔加樣（每孔的細菌量為5×104），平行加1排12孔。最后1排留作質(zhì)控、空白、陽性對照各4孔，對照方法同上。加蓋37℃培養(yǎng)24 h。生物膜形成后，傾去培養(yǎng)液，無菌生理鹽水洗滌3次，拍干。無菌每排加入以肉湯倍比稀釋的白藜蘆醇溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取各孔培養(yǎng)液接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜，觀察最低抑菌濃度。

2　結(jié)　果

2.1白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌的抗菌作用見表1。結(jié)果示白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌有明顯抑制作用，且隨著藥物濃度增加，對細菌增殖抑制作用逐漸增強。其MIC50為78.13 μg/mL；當藥物濃度達到19.53 μg/mL時開始對鮑曼不動桿菌生物膜有抑制作用，其SMIC50為312.5 μg/mL。

表1　白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌抑制作用（μg/mL）

2.2白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌累計抑菌率見表2和圖1。結(jié)果示，當白藜蘆醇濃度達到2500 μg/mL時，其對鮑曼不動桿菌的抑菌率達到100%。

2.3白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌生物膜抑制作用見表3。從表中可看出，當藥物濃度達到19.53 μg/mL時開始對鮑曼不動桿菌生物膜顯示有抑制作用，其抑制生物膜生長的最低抑菌濃度（SMIC50）為312.5 μg/mL。

表2　白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌累計抑菌率

圖1　白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌累計抑菌率

表3　白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌生物膜抑制作用（μg/mL）

3　討　論

細菌生物膜是指細菌在生長過程中黏附于有生命或無生命物體表面，由其自身分泌的胞外多聚體及其基質(zhì)網(wǎng)組成的三維結(jié)構(gòu)的菌細胞群體［9］。細菌生物膜是細菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因［10］。研究證實，有生物膜形成能力的鮑曼不動桿菌菌株的耐藥率顯著高于無生物膜形成能力的菌株［11］。中草藥可抑制鮑曼不動桿菌生物膜的形成［12］。白藜蘆醇屬于非黃酮類多酚化合物，是植物在遇到真菌感染或紫外線照射等不利條件時產(chǎn)生的植物防御素，對植物本身起保護作用，其具有抗癌、保護心血管系統(tǒng)、雌激素樣作用和抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抑菌等多種生理活性［13］。白藜蘆醇對于真菌、球菌及部分革蘭氏陰性桿菌具有很好抗菌活性，如金黃色葡萄球菌［14］、白色念珠菌、變形桿菌等［15］。

本研究結(jié)果表明，白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌的MIC50為78.13 μg/mL，MIC90為312.5 μg/mL，說明白藜蘆醇具有較好的抗菌作用。利用微量稀釋法觀察白藜蘆醇對鮑曼不動桿菌生物膜的抑制實驗顯示，白藜蘆醇能有效地抑制和破壞鮑曼不動桿菌生物膜，其SMIC范圍為19.53～5000 μg/mL，SMIC50為312.5 μg/mL。有作者推測，白藜蘆醇能干擾細菌細胞壁的合成，同時損傷細胞膜，影響菌體細胞周期，干擾胞內(nèi)物質(zhì)合成，并且藥物進入細胞壁后，使細胞酸堿和離子平衡失調(diào)，導(dǎo)致細胞器損傷，從而發(fā)揮抗菌作用［16］。

本研究為進一步利用中藥研發(fā)清除鮑曼不動桿菌生物膜的新藥提供了實驗依據(jù)，由于本研究是體外實驗，其臨床應(yīng)用價值還需更深入的研究。

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Inhibition Study of Resveratrol on Biofilm of Acinetobacter Bauman

YIN Wanghu，CAO Meilin，LI Jia，et al. Zhenjiang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Zhenjiang 212003，China.

R285文獻標志碼：A

1004-745X（2016）06-1011-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.019

江蘇省鎮(zhèn)江市社會發(fā)展計劃（SH2012051）

（2016-01-06）