呼吸道合胞體病毒F蛋白二級結構分析及其B細胞表位預測

易高，潘嘉宇，林純意，劉兆宇

(廣州醫科大學附屬第五醫院，廣州510700)

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呼吸道合胞體病毒F蛋白二級結構分析及其B細胞表位預測

易高，潘嘉宇，林純意，劉兆宇

(廣州醫科大學附屬第五醫院，廣州510700)

目的分析呼吸道合胞體病毒(RSV)F蛋白的二級結構并預測其B細胞表位。方法分析RSV F蛋白的二級結構，得出RSV F蛋白中可能出現的信號肽序列以及位置。基于同源建模的方法預測RSV F蛋白的三級結構，以三級結構為基礎預測F蛋白中可能存在的構象B表位和線性B表位。結果F蛋白的574個編碼氨基酸中占主要比例的是絲氨酸(10.45%)、亮氨酸(10.28%)、天冬酰胺(8.71%)和蘇氨酸(8.71%)；可能有7個蛋白結合位點、6個產生螺旋結構的區域；可能存在兩個主要的β-折疊片蛋白；F蛋白N-末端第1～25區段為信號肽。RSV F蛋白頭部主要由β-折疊片、無規則卷曲和轉角組成，尾部主要由兩段長的α-螺旋組成。RSV F蛋白中可能存在4個構象B表位、8個線性B表位。結論F蛋白編碼氨基酸主要為絲氨酸和亮氨酸，可能有7個蛋白結合位點、6個產生螺旋結構的區域、兩個主要的β-折疊片蛋白。 RSV F蛋白中可能存在4個構象B表位、8個線性B表位。

呼吸道合胞體病毒；F蛋白；蛋白二級結構；B細胞表位

呼吸道合胞體病毒(RSV)是一種常見嬰幼兒氣道感染和炎癥的病原體[1,2]。研究發現，RSV感染是誘發哮喘的危險因素，其致病性遠超其他微生物病原體[3]。研究和開發RSV疫苗、抗體藥物以及檢測試劑盒具有重要的臨床意義。RSV屬于副黏液病毒科，是一種不分節段的單股負鏈RNA病毒。RSV基因組大小約為15 kb，共編碼10種不同的病毒蛋白，其中NS1蛋白、NS2蛋白和SH蛋白為RSV非結構蛋白，而G蛋白、F蛋白、M1蛋白、M2蛋白、P蛋白、L蛋白、N蛋白等7種蛋白為RSV結構蛋白[4]。G蛋白和F蛋白是RSV的兩個表面糖蛋白，能促進機體保護性抗體的表達[5,6]。G蛋白又稱為附著蛋白，在病毒吸附到宿主細胞表面的過程中發揮作用，而F蛋白是一種融合性包膜糖蛋白，在病毒包膜與宿主細胞膜融合過程中發揮作用[7,8]。不同RSV亞型之間G蛋白變異較大，而F蛋白相對比較保守，不同亞型之間同源性較高，針對F蛋白產生的抗體在不同亞型之間具有交叉保護作用，因此一般以F蛋白作為開發疫苗、診斷試劑的研究對象[9]。本研究通過分析RSV F蛋白的二級結構，預測其可能的B細胞表位，旨在為RSV疫苗、治療性抗體及診斷檢測試劑盒的開發奠定基礎。

1　材料與方法

1.1RSV F蛋白二級結構分析

1.1．1RSV F蛋白氨基酸序列從GenBank中選取近年來在越南南部地區分離的RSV基因組序列(登錄號：KJ939966)為研究對象[10]，獲得RSV F蛋白編碼基因及氨基酸序列，F蛋白基因位于5651、7375，核苷酸長度為1 725 bp，氨基酸長度574 aa，氨基酸序列為MELPILNTNAITTILAAVTLCFTSSQ-NITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI-KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQS-TPAANSRARRELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKRKR-RFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALL-STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK-QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPV-STYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQ-SYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLC-TTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETC-KVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKI-MTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIK-TFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLY-VKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFI-RKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGL-LLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN。

1.1.2RSV F蛋白的二級結構分析通過蛋白結構在線預測網站Predict Protein Server(http://www.predictprotein.org/)分析F蛋白的二級結構，對F蛋白的氨基酸組成以及蛋白序列中可能存在的蛋白結合區域、α-螺旋區域、β-折疊區以及其他不規則區域進行分析，同時預測蛋白結構中可能的暴露區域和隱藏區域。

1.1.3RSV F蛋白的信號肽分析通過在線服務器上的信號肽預測軟件SignalIP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)，采用神經網絡算法(NN)和隱馬爾可夫模型(HMM)分析RSV F蛋白中可能出現的信號肽序列以及位置。

1.2RSV F蛋白三級結構及B細胞抗原表位的預測基于同源建模的方法，通過在線服務器軟件SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)預測RSV F蛋白的三級結構，并通過PyMOL Viewer分析并輸出預測的三級結構。綜合比較分析上述方法，以RSV F蛋白的三級結構為基礎，采用Ellipro(http://tools.immuneepitope.org/ellipro/)在線服務器程序預測F蛋白中可能存在的構象B表位，得分大于0.5(軟件默認值)則預測為優勢構象B表位。選取親水性強、表面可及性好以及抗原性高的區域作為線性B細胞表位預測的備選區域，并且排除序列中的N-末端的信號肽序列、C-末端跨膜區及位于病毒囊膜內部的序列。Ellipro服務器軟件預測F蛋白中可能存在的線性B表位，得分大于0.5(軟件默認值)則預測為優勢線性B表位。

2　結果

2.1RSV F蛋白二級結構F蛋白的574個編碼氨基酸中占主要比例的是絲氨酸(S,10.45%)、亮氨酸(L,10.28%)、天冬酰胺(N,8.71%)和蘇氨酸(T,8.71%)，見圖1。可能蛋白結合位點有7個，主要位于蛋白N-末端第100～135、260～350、400～430區段；可能產生螺旋結構的區域有6個，分別為N-末端第29～48、82～96、134～233、377～385和490～550區段；可能存在兩個主要的β-折疊片，分別位于N-末端第275～374和395～475區段；此外，在蛋白中還可能包含有1個跨膜結構區域(N-末端第525～545區段)和1個小的無序結構(N-末端第126～128區段)。整個蛋白暴露區域和隱藏區域均勻相間分布，無大片段暴露區域或者隱藏區域，見圖2。

2.2RSV F蛋白信號肽RSV F蛋白的信號肽預測結果見圖3；NN(圖3A)和HMM(圖3B)結果表明F蛋白N-末端第1～25區段為信號肽。

2.3RSV F蛋白三級結構、B表位根據SWISS-MODEL同源建模結果表明RSV F蛋白分為較大的頭部和細長的尾部組成，頭部主要由β-折疊片、無規則卷曲和轉角組成(暴露于病毒囊膜外，容易形成抗原表位)，而尾部主要由兩段長的α-螺旋組成，并且包括跨膜區(鑲嵌于病毒囊膜內部，難以形成抗原表位予以排除)。經過Ellipro預測分析表明RSV F蛋白中可能存在4個構象表位：表位①由N-末端第61～108、110～112、198～225、227～228、231、234～235、291～295區段組成，該表位的得分為0.702；表位②由N-末端第114～133、141、146區段組成，表位得分為0.678；表位③由N-末端第421、423～435、444～449、451、453～454、456、458～461區段組成，表位得分為0.609；表位④由N-末端第264～269區段組成，表位得分為0.533，見圖4。F蛋白存在8個潛在線性B表位，分別位于N-末端第61～134、198～228、178～186、418～435,152～166,291～295、264～269和444～464區段，各個表位的預測得分分別為：0.728、0.721、0.649、0.621、0.618、0.569、0.533、0.515。

圖1　RSV F蛋白氨基酸組成

圖2　RSV F蛋白二級結構

3　討論

RSV是引起嬰幼兒感染并誘發支氣管炎、肺炎的常見病原，幾乎所有的兒童都都有經歷過一次或者多次感染，對人們的生活、工作造成了極大的威脅[11]。疫苗的研制和應用是目前用于防治病毒感染最為有效的手段，表位疫苗由于制備簡單、效果突出、毒副作用小等特點而成為新型RSV疫苗研制的熱點和趨勢[12～14]。抗原優勢表位的確定是疫苗研制、臨床應用的基礎，其所采用的方法主要有結構測定、免疫學鑒定和生物信息學等方法，前兩種由于比較耗時耗力，周期較長而在具體的表位疫苗研制開發中應用較少，生物信息學方法簡單可靠而越來越受到研究者的信賴和關注[15～18]。基于疫苗開發、單克隆抗體制備以及快速檢測試劑盒的開發，采用生物信息學方法對RSV中的一些關鍵性蛋白進行二級結構和B細胞表位的預測具有重要的意義。

注：圖A為NN對RSV F蛋白信號肽的預測結果；圖B為HMM對RSV F蛋白信號肽的預測結果。

圖3RSV F蛋白信號肽預測結果

圖4　RSV F蛋白三級結構和構象B細胞抗原表位。

F蛋白是RSV編碼的一種多功能膜蛋白，在病毒侵染融合過程中發揮關鍵作用[19]。相對于RSV編碼的其他膜蛋白而言，F蛋白在不同亞型之間保守性較高，針對F蛋白產生的抗體在不同的亞型之間具有交叉反應，因此針對F蛋白開發相關的表位抗體在RSV的診療都具有較為重要的意義。B表位由線性表位和構象表位組成，蛋白中α-螺旋、β-折疊等二級結構由于結構比較穩定、鍵能高，并且通常處于蛋白質分子的內部而很難形成抗原表位與相應的抗體分子結合；無規則卷曲、轉角等二級結構由于結構較為松散，容易發生構象改變，并且通常處于蛋白質結構的表面而往往易于形成與抗體發生結合的穩定位點，因此這些位置往往易于形成抗原B表位[20,21]。另外，蛋白的疏水性區域往往位于蛋白的內部，而親水性區域位于蛋白表面。因此在蛋白質潛在抗原表位預測過程中，必須要綜合考慮親水性、表面可及性、柔韌性等，避免疏水區域、α-螺旋和β折疊區域[22,23]。在本研究中，我們首先通過Predict Protein Server，結果顯示F蛋白中可能包含有6個產生螺旋、2個產生β折疊片的區域，另外還包含有7個可能的蛋白質相互作用位點(見圖2)，提示F蛋白可能參與多種蛋白或其它分子之間的相互作用并在RSV感染過程中發揮重要作用，可對F蛋白的相關功能位點進行深入研究，進一步的揭示RSV的侵染機制。在預測了F蛋白二級結構的基礎上，我們又通過Swiss-model預測了F蛋白的三級結構，并通過Ellipro Prediction對F蛋白中可能的線性B表位和構象B表位進行了預測，結果表明F蛋白中存在較多的線性B表位和構象B表位(見圖4)，這可能與RSV F蛋白分子量較大、結構較為復雜相關。對于進一步的確認F蛋白的優勢表位信息，需要通過體外試驗、動物模型等來進行驗證，本研究預測的相關線性表位、構象表位將為下一步F蛋白抗原表位的確證、診療抗體的開發等提供一定的依據和參考。

基于上述研究結果，我們將在下一步的研究工作中通過構建RSVF蛋白的表達載體，開發能對RSV進行快速檢測的膠體金試劑盒。通過參考上述的B細胞表位預測結果，合成部分優勢表位序列用于嘗試構建和制備針對F蛋白的人源化單克隆抗體，為RSV感染的治療性抗體開發奠定基礎。

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Secondary structure and prediction of B cell epitope of F protein in respiratory syncytial virus

YI Gao,PAN Jiayu,LIN Chunyi,LIU Zhaoyu

(The 5th Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510700,China)

ObjectiveTo analyze the secondary structure and predict its B cell epitope of F protein in respiratory syncytial virus(RSV).MethodsWe analyzed the secondary structure of RSV F protein and obtained the sequence and location about the signal peptide in RSV F protein.Based on the homology modeling method,we predicted the potential conformational B epitopes and linear B epitopes in RSV F protein.ResultsAmong the 574 amino acids of RSV F protein,the major amino acids were serine(10.45%),leucine(10.28),asparagine(8.71%)and threonine(8.71%).There might be 7 protein binding sites,6 helical structure generation regions and 2 β-plated sheets in F protein.The sites 1-25 of N-terminus in F protein were signaling peptides.The head of the F protein was mainly composed by β-plated sheets,random coils and turns,while the tail was mainly composed by 2 long α-helixes.Eight linear B epitopes and four conformational B epitopes were predicted in F protein.ConclusionsSerine and leucine occupy the maximum ratio of amino acids encoding F protein.There might be seven protein binding sites,six helical structure generation regions,two major β-plated sheets in F protein,and RSV F protein may contain four conformational B epitopes and eight linear B epitopes.

respiratory syncytial virus;F protein;secondary structure of protein;B cell epitope

國家自然科學基金青年科學基金項目(81400013)；廣東省科技計劃自助項目(2014A020212329)。

易高(1977-)，男，碩士，副主任醫師，主要研究方向為氣道炎癥與氣道疾病。E-mail：15360802191@163.com

簡介：劉兆宇(1983-)，男，博士，助理研究員，主要研究方向為先天性免疫與氣道疾病。E-mail：sysu1924@gmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.006

R392.11

A

1002-266X(2016)27-0020-04

2016-02-11)