脂氧素對巨噬細胞RAW264.7的抗炎實驗研究*

謝大澤，黃利興，劉東升，朱　俊，謝　勇，周南進,△

(1.江西省醫學科學研究院，南昌 330006；2.南昌大學第一附屬醫院消化內科，南昌 330046；3.贛南醫學院第一附屬醫院消化內科，江西贛州 341000；4.南昌大學免疫與生物治療研究所，南昌 330006)

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·論著·

脂氧素對巨噬細胞RAW264.7的抗炎實驗研究*

謝大澤1，黃利興2,3，劉東升2，朱俊4，謝勇2，周南進1,4△

(1.江西省醫學科學研究院，南昌 330006；2.南昌大學第一附屬醫院消化內科，南昌 330046；3.贛南醫學院第一附屬醫院消化內科，江西贛州 341000；4.南昌大學免疫與生物治療研究所，南昌 330006)

目的研究脂氧素(LX)A4和叔丁氧羥基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)對LPS作用巨噬細胞RAW264.7存活的影響。方法取對數生長期的巨噬細胞RAW264.7為研究載體，實驗用不同濃度的脂多糖(LPS)在不同時間點處理細胞，觀察LX A4和BOC-2對LPS作用巨噬細胞RAW264.7后的存活率。CCK-8法觀察LPS對各組巨噬細胞RAW264.7的不良反應，Western blot法檢測LX A4和BOC-2對LPS處理后巨噬細胞RAW264.7的Toll樣受體4(TLR4)和pNF-κB p65蛋白水平，酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測LX A4和BOC-2對LPS處理后巨噬細胞RAW264.7培養上清液中白細胞介素6(IL-6)水平。結果在1 000 ng/mL濃度LPS組，作用時間6 h，巨噬細胞RAW264.7內TLR4蛋白水平和pNF-κB p65 蛋白水平顯著高于其余各組(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4組細胞存活率顯著高于對照組(P<0.05)；BOC-2組在LPS作用后巨噬細胞RAW264.7的存活率顯著低于無LPS作用(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4組pNF-κB p65 蛋白水平低于對照組及BOC-2組(P<0.05)，BOC-2組pNF-κB p65蛋白水平高于其余各組(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4組IL-6的水平低于對照組及BOC-2組(P<0.05)。結論LX A4能夠抑制LPS對巨噬細胞RAW264.7的作用及TLR4/NF-κB信號通路的激活，有助減輕炎性反應。

脂多糖類；脂氧素類；脂氧素A4；RAW264.7；核轉錄因子

脂氧素(lipoxin，LX)是繼前列腺素之后的又一重要花生四烯酸代謝產物，在炎癥疾病的組織中廣泛表達，LX A4最具抗炎作用，其主要通過抑制核轉錄因子Kappa B(NF-κB)的活性及促炎因子的釋放發揮抗炎作用[1]。LX除了抑制促炎細胞因子外，也可促進抗炎因子如白細胞介素(IL-4)、白細胞介素10(IL-10)等的產生[2]，這種協調作用能產生強效的抗炎效應。叔丁氧羥基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)是脂氧素受體的拮抗劑，與LX競爭性結合于脂氧素受體，從而阻礙LX與其受體的結合，對LX與其受體的結合起拮抗性作用。本文以巨噬細胞RAW264.7為研究載體，研究LX A4和BOC-2對脂多糖(LPS)作用巨噬細胞的存活、信號通路及細胞因子分泌的影響，旨在為LX A4抗炎作用及機制提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料巨噬細胞RAW264.7，由南昌大學第一附屬醫院消化研究所保存；DMEM購于HyClone公司；LX A4購于Cayman公司；BOC-2購于US Biological公司；LPS購于Sigmal公司；二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶有限公司；CCK-8購于上海貝博生物有限公司；Toll樣受體4(TLR4)抗體購于Abcam公司；pNF-κB p65抗體購于Santacruz公司；細胞因子信號轉導抑制因子 2(SOCS2)抗體購于Abcam公司；酶聯免疫試劑(ELISA)試劑盒購于上海點亮生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養巨噬細胞RAW264.7用10%胎牛血清的DMEM培養。將10 μL細胞懸液加入細胞計數板內，靜置后顯微鏡下計數。細胞密度(/mL)=(4個方格內細胞總數/4)×稀釋倍數×104。

1.2.2實驗分組(1)LPS作用巨噬細胞RAW264.7實驗分為4組。①實驗1組：用10 ng/mL LPS處理巨噬細胞RAW264.7；②實驗2組：用100 ng/mL LPS處理巨噬細胞RAW264.7；③實驗3組：用1 000 ng/mL LPS處理巨噬細胞RAW264.7；④實驗4組：用10 000 ng/mL LPS處理巨噬細胞RAW264.7。并設立對照組：無任何藥物處理巨噬細胞RAW264.7。分別在LPS作用2、4、6 h后提取細胞蛋白。(2)LX A4和BOC-2對LPS作用巨噬細胞RAW264.7存活的影響。①對照組：不加任何藥物處理巨噬細胞RAW264.7；②LX A4組：用300 nmol/L LX A4處理巨噬細胞；③BOC-2組：用10 μmol/L BOC-2處理RAW264.7細胞。

1.2.3CCK-8法檢測巨噬細胞RAW264.7毒性取生長良好的對數期巨噬細胞RAW264.7，按5×104/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，吸棄培養液，按上述實驗分組分別加入含有LX A4和BOC-2的培養液預處理15 min；同時設定空白孔，每組設5個復孔。按要求加LPS作用，每孔200 μL，培養6 h后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養2 h。按CCK-8試劑盒說明書操作。

1.2.4ELISA法檢測IL-6水平采用多因子蛋白生物標志物檢測系統檢測各組細胞培養上清液中IL-6水平，根據多因子分析試劑盒說明書進行操作。

1.2.5Western blot法檢測TLR4、pNF-κB p65蛋白水平根據巨噬細胞RAW264.7計數結果，將3組實驗按1×106/孔細胞接種于6孔細胞培養板中，搖勻后置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。實驗選取對數生長期細胞，Western blot檢測各組巨噬細胞RAW264.7內TLR4、pNF-κB p65蛋白水平。

2　結　　果

2.1LPS對巨噬細胞RAW264.7內TLR4蛋白水平的影響不同濃度LPS作用巨噬細胞2 h后，實驗1組、實驗2組和實驗3組TLR4蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)；作用4 h，實驗3組顯著高于其余各組(P<0.05)；作用6 h，在一定濃度范圍內巨噬細胞RAW264.7內TLR4 蛋白水平隨LPS濃度增加而增加，其中實驗3組顯著高于其余各組(P<0.05)。同一濃度LPS作用巨噬細胞RAW264.7不同時間，實驗3組的TLR4 蛋白水平在4、6 h顯著高于2 h(P<0.05)，同時6 h顯著高于4 h(P<0.05)，見表1。

表1　　各組巨噬細胞不同時間點RAW264.7TLR4

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與實驗1組比較；c：P<0.05,與實驗2組比較；d：P<0.05,與實驗4組比較；e：P<0.05,與同組2 h比較；f：P<0.05,與同組4 h比較。

2.2LPS對巨噬細胞RAW264.7內pNF-κB p65蛋白水平的影響不同濃度LPS作用巨噬細胞RAW264.72 h，實驗3組pNF-κB p65蛋白水平顯著高于其余各組(P<0.05)；作用4 h，實驗3組pNF-κB p65蛋白水平顯著高于其余各組(P<0.05)；作用6 h，在一定濃度范圍內，巨噬細胞RAW264.7內pNF-κB p65 蛋白水平隨LPS濃度增加而增加，其中實驗3組顯著高于其余各組(P<0.05)。同一濃度LPS作用巨噬細胞RAW264.7不同時間，實驗2組、實驗3組的pNF-κB p65 蛋白水平在6 h顯著高于2 h(P<0.05)，見表2。

表2　　各組巨噬細胞不同時間點RAW264.7pNF-κB p65

a：P<0.05,與實驗3組比較；b：P<0.05,與同組2 h比較。

2.3LX A4和BOC-2對LPS作用巨噬細胞RAW264.7存活的影響在無LPS作用下，LX A4組對巨噬細胞RAW264.7的存活率無影響(P>0.05)；在LPS作用下，LX A4組(108.76±5.66)的巨噬細胞RAW264.7存活率顯著高于對照組(84.40±4.46)及BOC-2組(83.10±7.69)，差異有統計學意義(P<0.05)。而同時在對照組及BOC-2組，LPS作用后巨噬細胞RAW264.7的存活率顯著低于無LPS作用后的存活率(P<0.05)。

2.4LX A4和BOC-2對LPS作用巨噬細胞RAW264.7 TLR4蛋白水平的影響無論有無LPS作用，巨噬細胞RAW264.7的蛋白水平在各組之間差異無統計學意義(P>0.05)。而在LPS作用下，巨噬細胞RAW264.7的TLR4蛋白水平顯著高于相對應的無LPS作用的蛋白水平(P<0.05)，見表3。

表3　　LX A4對TLR4蛋白水平的影響

a:P<0.05，與無LPS比較。

2.5LX A4和BOC-2對LPS作用巨噬細胞RAW264.7內pNF-κB p65蛋白水平的影響在無LPS作用下，各組巨噬細胞RAW264.7內的pNF-κB p65蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。在LPS作用下，LX A4組(0.64±0.08)pNF-κB p65 蛋白水平低于對照組(0.86±0.06)及BOC-2組(1.07±0.16)，差異有統計學意義(P<0.05)；BOC-2組pNF-κB p65蛋白水平高于其余各組(P<0.05)，同時對照組及BOC-2組高于相對應的無LPS組(P<0.05)；而LX A4組，無論有無LPS作用，pNF-κB p65蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6LX A4和BOC-2對LPS作用巨噬細胞RAW264.7分泌IL-6水平的影響在無LPS作用下，各組巨噬細胞RAW264.7培養上清液中IL-6的水平差異無統計學意義(P>0.05)；在LPS作用下，LX A4組(78.20±11.06)IL-6的水平低于對照組(154.56±47.70)及BOC-2組(148.03±29.65)，差異有統計學意義(P<0.05)；無論有無LX A4和BOC-2處理，LPS作用巨噬細胞RAW264.7培養上清液中IL-6的水平顯著高于相應的無LPS作用的IL-6水平(P<0.05)。

3　討　　論

LX是重要的內源性抗炎介質，對多種炎性細胞和炎性反應起負性調節，具有廣泛的抗炎及促炎癥消退作用，在發揮抗炎活性時通過不同方式調控多種炎癥信號通路，被譽為是中性粒細胞介導的組織損傷的“停止信號”或“剎車信號”[3]。

TLRs蛋白家族是一組能夠識別病原微生物及內源性組織損傷信號的高度保守的跨膜蛋白家族。在組織受損或炎癥浸潤狀態下，TLRs與病原體相關分子模式(PAMPs)結合后啟動一系列胞內級聯信號通路的活化，從而調控固有免疫與獲得性免疫，以及組織細胞的損傷與修復。TLR4/NF-κB信號通路是聯系機體固有免疫與獲得性免疫的橋梁，在調節腸道炎癥、防御病原體入侵及維持腸腔內環境穩態中起重要作用[4]。

LPS是TLR4的天然配體，在髓樣分化蛋白2(MD-2)及CD14分子的參與下，LPS與TLR4結合后能夠通過髓樣分化因子(MyD88)依賴和MyD88非依賴途徑激活下游信號通路，其中MyD88依賴途徑進一步募集并活化下游的腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)，活化的TRAF6經由MAPK信號通路及NF-κB信號通路，最終引起一系列的免疫和炎性反應[5]。正常腸黏膜TLR4蛋白低表達，而黏膜固有層巨噬細胞不表達CD14分子，在炎癥性腸病(IBD)中TLR4及CD14的表達上調，并伴有炎癥細胞因子的分泌增加[6]，提示TLR4信號通路的異常激活在IBD的發生、發展中起重要作用。

王艷艷等[7]應用內化抑制劑構建內化障礙的小鼠巨噬細胞RAW264.7模型，發現LPS-TLR4 復合物內化與LPS 介導巨噬細胞活化密切相關,內化障礙條件下,由LPS 介導的細胞活化表現為對IL-6 的釋放受到顯著抑制,而對腫瘤壞死因子α(TNF-α)的釋放則抑制不顯著。本研究發現，相同濃度LPS作用巨噬細胞RAW264.7不同時間，細胞內pNF-κB p65蛋白水平呈時間依賴性，且在6 h時作用最為明顯；提示巨噬細胞RAW264.7對外界適宜的刺激需要一定的反應時間，激活NF-κB信號通路后需要經過一系列的胞內級聯反應，最終才引起炎性反應。本研究發現，在無LPS作用下，LX A4對pNF-κB蛋白水平無影響，提示在生理情況下不起作用有關；在LPS作用下，LX A4作用的同時，與對照組相比，pNF-κB p65蛋白水平下降。Mcberry等[8]發現，LX的作用機制是通過上調SOCS-2的表達、加速TRAF6的降解，進而抑制NF-κB信號通路的激活，防止炎癥擴散。本研究表明，LX A4能夠減輕LPS所致巨噬細胞RAW264.7培養上清液中IL-6的水平。由此可見，抗炎因子與LX A4之間的正反饋作用，對炎癥的發展和轉歸起著作用。

綜上所述，LX A4能夠抑制巨噬細胞RAW264.7中NF-κB的激活，有減輕炎性反應的作用，因此有望成為炎性腸病(IBD)治療的新的契機。本實驗還有需進一步完善，為LX A4及LX在IBD中的作用機制提供更為強有力的證據。

[1]Romano M.Lipoxin and aspirin-triggered lipoxins[J].Sci World J,2010,10(1):1048-1064.

[2]Zhou XL,Yang QS,Ni SZ,et al.Protective effects of lipoxin a4 in testis injury following testicular torsion and detorsion in rats[J].Mediators Inflamm,2014:898056.

[3]周游，蔣興亮．脂氧素調控炎癥信號通路的研究進展[J]．中華臨床醫師雜志，2015，9(6)：989-993．

[4]Garcia-Rodriguez S,Arias-Santiago S,Perandres-Lopez RA,et al.Increased gene expression of toll-like receptor 4 on peripheral blood mononuclear cells in patients with psoriasis[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,27(2):242-250.

[5]Yu ZH,Huang F,Xu N,et al.Expression of toll-like receptor 4,CD14,and NF-kappaB in Chinese patients with ulcerative colitis[J].J Immunoassay Immunochem,2011,32(1):47-56.

[6]Campos N,Magro F,Castro AR,et al.Macrophages from IBD patients exhibit defective tumour necrosis factor-alpha secretion but otherwise normal or augmented pro-inflammatory responses to infection[J].Immunobiology,2011,216(8):961-970.

[7]王艷艷，鄭江．LPS-TLR4復合物內化障礙與LPS介導巨噬細胞活化的實驗研究[J]．重慶醫學，2011，40(23)：2291-2293．

[8]Mcberry C,Gonzalez RM,Shryock N,et al.SOCS2-induced proteasome-dependent TRAF6 degradation:a common anti-inflammatory pathway for control of innate immune responses[J].PLoS One,2012,7(6):e38384.

The preliminary study of LX A4 on the LPS-induced RAW264.7 cell line*

XieDaze1,HuangLixing2,3,LiuDongsheng2,ZhuJun4,XieYong2,ZhouNanjin1,4△

(1.DepartmentofGastroenterology，JiangxiAcademyofMedicalSciences,Nanchang,Jiangxi330046，China;2.DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330046，China;3.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000，China;4.InstituteofImmunomodulationandImmunotherapy,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006，China)

ObjectiveTo examine the effect of lipoxins (LX) A4 and its antagonist (BOC-2) on the survival rate of RAW264.7 macrophage.MethodsRAW264.7 were treated with different concentrations of LPS,and the cells were collected after 2,4,6 h respectively,then we observed the effect of LX A4 and BOC-2 on the survival rate of those cells.Cytotoxicity were detected by CCK-8 method.The expression of TLR4 and pNF-κB p65 in RAW264.7 were detected by Western blot.The expression of IL-6 in cell supernatant was measured by ELISA.ResultsThe protein expression of TLR4 and pNF-κB p65 treated with LPS for 6 h in 1 000 ng/mL of LPS group were higher than those of other groups(P<0.05).In the present of LPS,the survival rate of macrophage in the LX A4 group was significantly higher than that of the control group (P<0.05).Meanwhile,in the BOC-2 group,the survival rate of macrophage stimulated with LPS was significantly lower than the that of corresponding non-LPS group(P<0.05).Stimulated with LPS,the protein expression of pNF-κB p65 in the LX A4 group was significantly lower than those of the control group and the BOC-2 group (P<0.05),and the protein expression of pNF-κB p65 in the BOC-2 group was significantly higher than those of other groups(P<0.05).In the present of LPS,the concentration of IL-6 in the LX A4 group was significantly lower than those of the control group and the BOC-2 group (P<0.05).ConclusionLX A4 could inhibit the cytotoxicity of LPS and the activation of TLR4/NF-κB signaling pathway,then reduce the inflammation.

lipopolysaccharides；lipoxins；lipoxin A4；RAW264.7；nuclear factor kappa

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.002

國家自然科學基金資助項目(81160056)；江西省教育廳項目(2012，2014)。作者簡介：謝大澤(1962-)，副主任技師，本科，主要從事免疫學研究。△

，E-mail：jxznj@163.com。

R573.2

A

1671-8348(2016)14-1876-03

2015-11-15

2015-12-28)