Hp感染的功能性消化不良腹痛癥狀與P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽的關(guān)系*

何　平，田文廣，張小麗，鮑　淼，黃　劍

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院:1.消化內(nèi)科；2.感染科，重慶 402160)

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論著·臨床研究

Hp感染的功能性消化不良腹痛癥狀與P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽的關(guān)系*

何平1，田文廣2△，張小麗1，鮑淼1，黃劍1

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院:1.消化內(nèi)科；2.感染科，重慶 402160)

目的初步探討幽門螺桿菌(Hp)感染的功能性消化不良(FD)患者腹痛的發(fā)病機(jī)制。方法根據(jù)羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇以上腹痛為臨床表現(xiàn)的FD患者36例。胃鏡下Hp快速尿素酶及C13尿素呼氣試驗將36例患者分為Hp(+)組(n=20)和Hp(-)組(n=16)，同時選擇12例健康人設(shè)立對照組。免疫組織化學(xué)法檢測P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在各組組織中的密度值及明確SP、CGRP在細(xì)胞中的定位。視覺模擬評分將Hp感染的FD患者腹痛程度分為輕度、中度、重度，比較SP、CGRP在不同腹痛程度患者中的平均光密度值。結(jié)果Hp(+)組SP、CGRP的平均光密度值高于Hp(-)組(SP:0.056±0.016vs. 0.027±0.009；CGRP：0.073±0.018vs.0.034±0.009,P<0.05)。SP、CGRP在重度腹痛患者中的平均光密度值明顯高于中度腹痛者(SP:0.074±0.011vs. 0.055±0.012；CGRP:0.094±0.005vs. 0.075±0.009，P<0.05)；中度腹痛患者的平均光密度值明顯高于輕度腹痛者(SP:0.055±0.012vs. 0.043±0.008；CGRP:0.075±0.009vs. 0.054±0.010，P<0.05)。顯微鏡下觀察到CGRP位于胃竇腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，SP同樣位于胃黏膜細(xì)胞胞質(zhì)。 結(jié)論Hp感染的FD患者腹痛與SP、CGRP有關(guān)。

消化不良；腹痛；P物質(zhì)；降鈣素基因相關(guān)肽；Hp感染；功能性消化不良

羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)將功能性消化不良(FD)定義為起源于胃、十二指腸區(qū)域的癥狀，并且排除引起這些癥狀的器質(zhì)性、全身性或代謝性疾病，這些癥狀包括上腹痛、上腹燒灼感、餐后飽脹等[1-2]。目前FD以藥物治療為主，但治療效果不理想，明確FD的病因和發(fā)病機(jī)制以進(jìn)行針對性的治療成為近年來研究的熱點[3]。P物質(zhì)(substance P,SP) 是最早發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，廣泛分布于胃腸道、呼吸道、皮膚等組織和器官，它與疼痛關(guān)系密切，既可傳遞痛覺信息、產(chǎn)生疼痛，又有鎮(zhèn)痛作用[4-5]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是一種體內(nèi)分布廣泛的生物活性肽，CGRP在痛覺調(diào)控中起著重要作用，是與傷害性信息傳導(dǎo)密切相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)[6]。SP、CGRP是反映痛覺的重要指標(biāo)。Monnikes等[7]研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染陽性[Hp(+)]FD患者其疼痛閾值降低，胃黏膜中CGRP和SP的表達(dá)卻顯著升高，而目前國內(nèi)關(guān)于Hp(+)的FD患者胃黏膜CGRP和SP的水平變化鮮有報道。本研究按照羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)篩選以上腹痛為臨床表現(xiàn)的FD患者36例，采用免疫組織化學(xué)法檢測到SP、CGRP在Hp(+)組患者中的表達(dá)明顯高于HP感染陰性[Hp(-)]患者，Hp(+)FD患者腹痛程度越重，SP、CGRP表達(dá)越高，表明SP、CGRP在Hp(+)FD患者腹痛的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年1月至2014年12月就診于本院消化內(nèi)科門診的36例FD患者，均僅以上腹痛為臨床表現(xiàn)。其中，男15例，女21例，年齡20～50歲。同時，選取12例無上腹痛癥狀且無Hp感染的健康人為對照組。所有研究對象均簽署研究知情同意書。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)篩選FD患者，有上腹痛、上腹燒灼感、餐后飽脹等癥狀，內(nèi)鏡檢查陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有冠心病、有上消化道手術(shù)史，同時伴有腸易激綜合征者。

1.2方法

1.2.1主要試劑兔抗CGRP(武漢博士德生物)多抗，兔抗SP(武漢三鷹生物)多抗，山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)/辣根酶標(biāo)記(中杉金橋)；放射免疫分析法(RIPA)裂解液(強)，化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(Beyotime公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(中杉金橋)。

1.2.2FD的分組結(jié)合內(nèi)鏡下Hp快速尿素酶試驗及C13尿素呼氣試驗兩種方法將所有研究對象分為Hp(+)組和Hp(-)組，同時設(shè)立對照組。兩種試驗方法測得Hp均為陽性或陰性即可納入試驗組，否則不能歸入試驗組。嚴(yán)格按照羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)納入FD的36例患者，經(jīng)檢測后，Hp(+)20例，Hp(-)16例，所有患者均于胃小彎胃竇處取活檢，行免疫組織化學(xué)染色，計算平均光密度值(OD值)。

1.2.3腹痛程度的分組根據(jù)視覺模擬(VAS)評分標(biāo)準(zhǔn)[8]可將腹痛程度分級。其中，0分為無疼痛感覺；>0～<4分為輕度(有輕微的疼痛感，能忍受)；4～<7分為中度(疼痛并影響睡眠，尚能忍受)；7～10分為重度(有漸強烈的疼痛感，疼痛難忍，影響睡眠)。比較SP、CGRP在不同腹痛程度Hp(+)FD患者中的OD值。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測SP、CGRP在胃黏膜中的表達(dá)標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定后，以石蠟包埋、切片，滴加正常山羊血清封閉后，分別滴加一抗兔抗SP(武漢三鷹，1∶50)、兔抗CGRP(博士德，1∶100)抗體恒溫孵育1 h后，轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱孵育24～36 h，滴加生物素化山羊抗兔二抗恒溫孵育2 h，底物DAB/H2O2法染色，脫水透明封片。棕黃色為陽性反應(yīng)。

1.2.5SP、CGRP在各組胃黏膜中的OD值應(yīng)用計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)CMOS(日本OLYMPUS公司)及專用軟件(美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus)，計算隨機(jī)5個視野胃黏膜SP、CGRP表達(dá)的OD值，OD值越大，表示SP、CGRP水平越多。

2　結(jié)　　果

2.1一般情況比較本研究篩選的FD患者中，Hp(+)組的平均年齡為(39.50±6.72)歲，Hp(-)組為(38.44±7.47)歲，對照組為(38.33±8.83)歲；Hp(+)組的BMI為23.18±3.24，Hp(-)組為23.34±2.85，對照組為23.74±3.37。Hp(+)組、Hp(-)組、對照組3組BMI、年齡分布均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2SP、CGRP在各組胃黏膜中的OD值免疫組織化學(xué)法檢測到Hp(+)組SP、CGRP的OD值高于Hp(-)組(SP:0.056±0.016vs. 0.027±0.009；CGRP：0.073±0.018vs.0.034±0.009,P<0.05)；而Hp(-)組與對照組之間的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(SP:0.027±0.009vs. 0.022±0.007；CGRP:0.034±0.009vs. 0.029±0.008,P>0.05)，見圖1。

A：CGRPOD值比較；B：SPOD值比較。*：P<0.05，與Hp(+)組比較。

圖1CGRP、SP在各組組織中的OD值比較

2.3SP、CGRP在不同腹痛程度Hp(+)FD患者中的OD值按照VAS疼痛評分標(biāo)準(zhǔn)，輕度腹痛患者7例，中度8例，重度5例。SP、CGRP在重度腹痛患者中的OD值明顯高于中度腹痛者(SP:0.074±0.011vs. 0.055±0.012；CGRP:0.094±0.005vs. 0.075±0.009，P<0.05)；中度腹痛患者的OD值明顯高于輕度腹痛者(SP:0.055±0.012vs. 0.043±0.008；CGRP:0.075±0.009vs. 0.054±0.010，P<0.05)，見圖2。

A：不同腹痛程度的CGRPOD值比較；B：不同腹痛程度的SPOD值比較。*：P<0.05，與輕度腹痛比較；#：P<0.05，與重度腹痛比較。

圖2CGRP、SP在不同腹痛程度Hp(+)FD患者中的OD值比較

2.4SP、CGRP在胃黏膜中的分布人胃竇所取胃黏膜組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，鏡下所見CGRP、SP陽性細(xì)胞反應(yīng)呈棕黃色或棕褐色。CGRP陽性細(xì)胞位于胃竇腺上皮，CGRP充滿細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核為陰性；SP同樣位于胃黏膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核無表達(dá)，見圖3。

A：Hp(+)組胃黏膜CGRP染色；B：Hp(+)組胃黏膜SP染色；C：對照組CGRP染色；D：對照組SP染色。

圖3CGRP、SP在胃黏膜中的免疫組織化學(xué)染色觀察(×400)

3　討　　論

對健康人群及功能性胃腸病患者進(jìn)行生活質(zhì)量調(diào)查顯示，F(xiàn)D患者生活質(zhì)量最低，其社會功能、情感職能、精神健康維度和精神心理健康總評分顯著降低[9-11]。目前FD以藥物治療為主，但療效不明顯[3]，明確FD的病因和發(fā)病機(jī)制成為近年來研究的熱點和突破口。SP是最早發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，由11個氨基酸組成，屬于胃腸肽中的速激肽族，廣泛分布于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)，是傷害性傳入末梢釋放的一種興奮性遞質(zhì)，它與疼痛關(guān)系密切，既可傳遞痛覺信息，又具致痛作用[4-5]。朱建軍[12]研究表明，在多種慢性疼痛中，SP 作為疼痛遞質(zhì)通過感覺神經(jīng)傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞，參與疼痛在脊髓中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制。SP不僅在疼痛信息傳遞中起著重要作用，而且具有致痛作用。Henry[13]研究表明，大劑量SP可直接引起感覺神經(jīng)元興奮，導(dǎo)致痛覺過敏，并掩蓋鴉片樣物質(zhì)的止痛作用。CGRP是由37個氨基酸組成的神經(jīng)肽，廣泛分布于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)及心血管、消化、呼吸等系統(tǒng)，參與機(jī)體多種生理活動、功能的調(diào)節(jié)[14]。房春燕等[6]認(rèn)為，CGRP是與傷害性信息傳遞密切相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)，在痛覺調(diào)控過程中起著重要作用。綜上所述，CGRP、SP是反映痛覺的重要指標(biāo)，也是傷害性信息傳入的神經(jīng)遞質(zhì)。

Monnikes等[7]研究者證實，Hp(+)的FD患者其胃容量擴(kuò)張的不適閾值和疼痛閾值降低，胃黏膜中CGRP和SP表達(dá)水平卻顯著升高，得出CGRP、SP神經(jīng)肽與FD發(fā)病機(jī)制有關(guān)的結(jié)論。而目前國內(nèi)關(guān)于胃黏膜CGRP、SP神經(jīng)肽是否參與FD發(fā)病機(jī)制的研究報道甚少。李啟祥等[15]研究表明，F(xiàn)D感知過敏組患者胃黏膜中SP、CGRPOD值高于FD感知正常組及健康人，SP、CGRP在FD患者的發(fā)病中可能起著較重要的作用，與本試驗研究結(jié)果相同。

綜上所述，以上研究結(jié)果表明SP、CGRP神經(jīng)肽與Hp(+)FD患者腹痛的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，為今后深入研究FD患者的藥物治療提供靶點。

[1]Fang YJ,Liou JM,Chen CC,et al.Distinct aetiopathogenesis in subgroups of functional dyspepsia according to the Rome Ⅲ criteria[J].Gut,2015,64(10):1517-1528.

[2]Tack J,Talley NJ,Camilleri M,et al.Functional gastroduodenal disorders[J].Gastroenterology,2006,130(5):1466-1479.

[3]Stein B,Everhart KK,Lacy BE.Treatment of functional dyspepsia and gastroparesis[J].Curr Treat Options Gastroenterol,2014,12(4):385-397.

[4]Raap M,Rüdrich U,St?nder S,et al.Substance P activates human eosinophils[J].Exp Dermatol,2015,24(7):557-559.

[5]王凌，李麗，司軍強．P物質(zhì)與疼痛的關(guān)系[J]．包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，25(5)：102-104．

[6]房春燕，李寧，史立宏，等．神經(jīng)性痛和炎性痛大鼠伏核內(nèi)CGRP mRNA表達(dá)的變化[J]．神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2007，23(2)：155-158．

[7]Monnikes H,Van Der Voort IR,Wollenberg BA,et al.Gastric perception thresholds are low and sensory neuropeptide levels high in Helicobacter pylori-positive functional dyspepsia[J].Digestion,2005,71(2):111-123.

[8]宋文閣．實用臨床疼痛學(xué)[M]．鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2008：530-531．

[9]平麗，李瑜元，聶玉強，等．功能性胃腸病患病情況調(diào)查[J]．實用醫(yī)學(xué)雜志，2003，19(4)：424-426．

[10]Halder SL,Locke GR,Schleck CD.Natural history of functional gastrointestinal disorders:a 12-year longitudinal population-based study[J].Gastroenterology,2007,133(3):799-807.

[11]張艷麗，宋志強，丁召路，等．上胃腸道功能和動力障礙性疾病患者的生活質(zhì)量評價[J]．胃腸病學(xué)，2006(8)：499-502．

[12]朱建軍．P物質(zhì)在脊髓痛覺機(jī)制中的作用研究進(jìn)展[J]．交通醫(yī)學(xué)，2007，21(3)：247-248,251．

[13]Henry JL.Future basic science directions into mechanisms of neuropathic pain[J].J Orofac Pain,2004,18(4):306-310.

[14]Russell FA,King R,Smillie SJ,et al.Calcitonin gene-related peptide:physiology and pathophysiology[J].Physiol Rev,2014,94(4):1099-1142.

[15]李啟祥，朱良如，侯曉華．功能性消化不良病人胃黏膜CGRP、SP免疫陽性纖維與胃機(jī)械感覺過敏的關(guān)系[J]．湖北民族學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2003，20(4)：1-4．

The relationship between the abdominal pain of functional dyspepsia with Hp infection and SP,CGRP*

HePing1，TianWenguang2△，ZhangXiaoli1，BaoMiao1，HuangJian1

(1.DepartmentofGastroenterology；2.DepartmentofInfectiousDiseases，YongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160，China)

ObjectiveTo explore the pathogenesis of abdominal pain in functional dyspepsia patients with H ylori(Hp) infection.MethodsAccording to the Rome Ⅲ diagnostic criteria,36 cases of functional dyspepsia patients with clinical manifestations of abdominal pain were selected.All cases were divided into Hp (+) group(n=20) and Hp (-) group(n=16) through gastroscope Hp rapid urease and C13 urea breath tests.And we chose 12 healthy subjects as control group.The mean optical density values of SP and CGRP in each group were detected by immunohistochemistry,and the localization of SP and CGRP in cells were detected.Functional dyspepsia patients with Hp infection were also divided into mild,moderate,severe abdominal pain degree by visual analogue scale (VAS),and then we compared the mean optical density value of SP and CGRP in patients with different abdominal pain.ResultsThe mean optical density of SP and CGRP in Hp (+) group were significantly higher than those in Hp (-) group (SP:0.056±0.016vs. 0.027±0.009；CGRP：0.073±0.018vs.0.034±0.009,P<0.05).The mean optical density of SP and CGRP in patients with severe abdominal pain were significantly higher than those in patients with moderate abdominal pain(SP:0.074±0.011vs. 0.055±0.012；CGRP:0.094±0.005vs. 0.075±0.009，P<0.05),and the expression of in patients with moderate abdominal pain was significantly higher than those patients with of mild abdominal pain (SP:0.055±0.012vs. 0.043±0.008；CGRP:0.075±0.009vs. 0.054±0.010，P<0.05).Under the microscope,CGRP was located in the cytoplasm of the glandular epithelial cells of the stomach,and SP was also located in the cytoplasm of gastric mucosa.ConclusionHp infection of functional dyspepsia patients with abdominal pain might be associated with SP,CGRP.

dyspepsia；abdominal pain；substance P；calcitonin gene-related peptide；Hp infection;functional dyspepsia

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.011

國家自然科學(xué)基金資助項目(81171526)；重慶市永川區(qū)自然科學(xué)基金計劃項目(YCSTC，2011BE5015)；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院院級課題(YJYB2011010)。作者簡介：何平(1966-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事功能性胃腸道疾病研究。△

，E-mail:TWG9366@163.com。

R57

A

1671-8348(2016)14-1906-03

2015-11-08

2016-03-19)