慢性乙型肝炎患者幽門螺桿菌感染狀況及肝組織螺桿菌屬特異性16SrRNA基因分析*

王曉忠，竇逾常，王　燕，莊小芳

慢性乙型肝炎患者幽門螺桿菌感染狀況及肝組織螺桿菌屬特異性16SrRNA基因分析*

王曉忠，竇逾常，王燕，莊小芳

目的分析慢性乙型肝炎患者幽門螺桿菌（Hp）感染狀況及肝組織螺桿菌屬特異性16SrRNA基因特點(diǎn)。方法納入維吾爾族CHB患者60例和健康維吾爾族體檢者80例，采用14C-尿素呼氣試驗(yàn)檢測(cè)H pylori陽性感染，常規(guī)進(jìn)行肝穿刺，采用PCR法檢測(cè)肝組織螺桿菌16SrRNA基因水平。結(jié)果慢性乙型肝炎每分鐘衰變數(shù)（14C-UBT）陽性率為85.00%，顯著高于對(duì)照組[60.24%，P<0.01]；在所謂的60例慢性乙型肝炎患者中，經(jīng)肝組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎46例，肝硬化14例；在46例CHB和14例肝硬化患者肝組織DNA進(jìn)行16 SrRNA基因檢測(cè)，結(jié)果40例（86.96%）CHB和13例（92.86%）肝硬化患者16 sRNA陽性，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.363，P>0.05）；輕度、中度與重度CHB患者肝組織16 sRNA檢出率亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=1.348，P=0.510）。結(jié)論慢性乙型肝炎患者幽門螺桿菌感染率較高，但肝組織螺桿菌屬特異性16SrRNA檢出率與乙型肝炎患者肝組織炎癥或纖維化程度未顯示出顯著性關(guān)聯(lián)。

慢性乙型肝炎；幽門螺桿菌；肝組織；螺桿菌屬特異性16SrRNA

【Abstract】ObjectiveTo analyze the Helicobacter pylori（Hp）infection status in Uygur patients with chronic hepatitis B in Xinjiang and helicobacter 16SrRNA gene in liver biopsy tissues.Methods60 patients with hepatitis B and 80 healthy persons were recruited in this study.14C-urea breathing test was used to detected Hp infection，and helicobacter 16SrRNA gene in liver biopsy tissues were detected by using real-time PCR and pathological examination was applied to determine histological activity index.ResultsThe14C-UBT positive rate was 85.00%in patients with hepatitis B，significantly higher than 60.24%in the controls（P<0.01）;14 out of 60 patients with hepatitis B were diagnosed with liver cirrhosis by histopathological examination;the positive rate of helicobacter 16SrRNA in liver tissues from patients with CHB were 86.96%，without significant difference as compared to 92.86%from patients with liver cirrhosis（x2=0.363，P>0.05）；there were no significantly statistical differences as respect to the positive rates of helicobacter 16SrRNA in liver tissues among 21，16 and 9 patients with hepatitis B of mild，moderate and severe degree（x2=1.348，P=0.510）.ConclusionThe infection of Hp in patients with CHB is common，but there is no significant evidence showing correlation of the specificity 16SrRNA of Hp to pathological grading and staging in liver tissues.

【Key words】Chronic hepatitis B；Helicobacter pylori；16SrRNA of Hp;Liver biopsy

既往研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H pylori）或螺桿菌屬合并乙型肝炎病毒（HBV）感染可能進(jìn)一步加重慢性肝損害[1~4]。因此，根除治療H pylori感染可能使慢性肝炎患者受益[5~7]。

既往已進(jìn)行了一些H pylori感染與肝硬化相關(guān)并發(fā)癥之間的相關(guān)性研究，得到了一致的肯定結(jié)果[8，9]，但對(duì)H pylori感染與CHB患者肝纖維化程度之間的關(guān)系報(bào)導(dǎo)不一[10，11]。維吾爾族是新疆主要的少數(shù)民族。在2005年末，維吾爾族人口約為923.50萬，占新疆總?cè)丝诘?5.94%。近年有報(bào)道，維吾爾族人口已突破千萬。2004年在和田地區(qū)進(jìn)行的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，維吾爾族人口HBV感染率為1.48%[12]，低于漢族（6.09%）。維吾爾族慢性乙型肝炎患者H pylori感染的狀況仍不清楚。本研究觀察了維吾爾族慢性乙型肝炎患者H pylori或螺桿菌屬感染的特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1病例來源選擇2013年4月至2014年12月在我院和新疆自治區(qū)人民醫(yī)院診治的維吾爾族CHB患者60例，男性48例，女性12例；平均年齡（41.33±11.48）歲。病程（8.64±8.25）年。CHB的診斷參照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[1]，同時(shí)參照2006年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì)發(fā)布的《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[13]。排除合并HCV感染、自身免疫性疾病、代謝性疾病、飲酒、藥物等致肝損害，排除肝衰竭、肝硬化、肝癌，排除伴有其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病或精神病、孕婦和哺乳期婦女。另選健康維吾爾族體檢者80例，男性40例，女性40例；平均年齡（46.46±16.45）歲，排除甲、乙、丙、戊型肝炎病毒感染，肝功能正常。

1.2肝穿刺活體組織檢查采取快速肝穿刺術(shù)。術(shù)前檢查血小板、凝血功能指標(biāo)、測(cè)血壓和脈搏。將活檢獲得的肝組織置入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，行常規(guī)HE染色，由病理科醫(yī)生進(jìn)行病理組織學(xué)診斷，同時(shí)行嗜銀染色，觀察是否有幽門螺桿菌菌體在肝內(nèi)定植。肝組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[14，15]：（1）輕度慢性肝炎：炎癥活動(dòng)度（G）1～2級(jí)，纖維化程度（S）0～2期；（2）中度慢性肝炎：G3，S1～3；（3）重度慢性肝炎：G4，S2～4。

1.314C-尿素呼氣試驗(yàn)患者口服1粒14C-尿素膠囊（深圳中核海得威生物科技有限公司，每粒含尿素14C 27.8 KBq和該公司生產(chǎn)的HUBP-01A Hp測(cè)試儀），待瓶中液體由紫紅色變?yōu)闊o色時(shí)，停止吹氣（1～3 min）。當(dāng)超過3 min褪色不全，也停止吹氣，向已采集呼氣樣品的集氣瓶?jī)?nèi)加入稀釋閃爍液=4.5 ml，搖勻，測(cè)量樣品每分鐘衰變數(shù)（14C-UBT）>100 dpm/mmol CO2%時(shí)，則判定為H pylori陽性。1.4血清HBV標(biāo)志物檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清乙型肝炎病毒標(biāo)志物（上海科華生物工程股份有限公司）。

1.5血清HBV DNA檢測(cè)采用熒光定量PCR法檢測(cè)（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。

1.6肝組織螺桿菌菌屬特異性16 SrRNA基因檢測(cè)取肝組織，采用3 S柱提取DNA（北京天根生化科技有限公司）。PCR反應(yīng)總體系為20μl，包括Taq DNA聚合酶1μl。10×Buffer 5 μl，25 M MgCl23.6 μl（終濃度為1.8 mM），10 mM dNTPs 1μl（終濃度為200 M），25 M引物各1 μl（終濃度分別為0.5 mM），DNA模板l μl，其余用滅菌水補(bǔ)足。相關(guān)引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。取螺桿菌16 SrRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，加入溴酚藍(lán)2 μl，點(diǎn)樣于含0.2%溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠中，100 V電壓電泳30 min，于紫外燈下觀察結(jié)果，并應(yīng)用紫外成像系統(tǒng)（Gel DocTM XR+imaging System，BIO RAD）拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，率的比較采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，即P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肝組織病理學(xué)分級(jí)和分期情況結(jié)果顯示，在60例CHB患者中，14例達(dá)到肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)，見表2。

2.2兩組人群14C-尿素呼氣試驗(yàn)陽性率比較CHB患者14C-UBT陽性率顯著高于對(duì)照組（x2=10.291，P<0.01，表3）。

2.3兩組14C-尿素呼氣試驗(yàn)水平比較結(jié)果顯示，CHB患者14C-UBT實(shí)測(cè)水平顯著高于對(duì)照組（t=4.238，P<0.01，表4）。

2.4 CHB與肝硬化患者肝組織螺桿菌屬特異性16 sRNA檢出率比較對(duì)46例CHB和14例肝硬化患者肝組織DNA進(jìn)行16 SrRNA基因檢測(cè)（圖1），結(jié)果40例（86.96%）CHB和13例（92.86%）肝硬化患者16 sRNA陽性，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.363，P>0.05）；輕度、中度與重度CHB患者肝組織16 sRNA檢出率亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=1.348，P=0.510，表5）。2.5血清HBV DNA陽性與陰性患者14C-尿素呼氣試驗(yàn)陽性率比較血清HBV DNA陽性與陰性者14C-UBT陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=2.348，P>0.05，表6）。

表1　螺桿菌菌屬特異性16 SrRNA基因引物序列及PCR反應(yīng)條件

表2　 60例CHB患者肝組織病理學(xué)分級(jí)和分期情況分布

表3　兩組人群14C-UBT陽性率（%）比較

表4　兩組人群14C-UBT實(shí)測(cè)水平（）比較

表4　兩組人群14C-UBT實(shí)測(cè)水平（）比較

①P<0.01

例數(shù)14C-UBT慢性乙型肝炎60502.07±360.36①健康人80199.37±93.48

表5　慢性肝炎與肝硬化患者肝組織16 sRNA檢出率（%）比較

表6　血清HBV DNA陽性與陰性者14C-UBT陽性率（%）比較

圖l　慢性HBV感染者肝組織螺桿菌菌屬特異性16 SrRNA基因擴(kuò)增情況（自左至右）：1，Marker；2～7，慢性肝炎；8～10，肝硬化

3　討論

H pylori與慢性胃炎、消化性潰瘍等胃腸道疾病的關(guān)系已被公認(rèn)。近年研究資料表明，H pylori不但引起許多慢性感染和免疫反應(yīng)，還參與了胃腸外疾病如心臟疾病、血液性疾病、風(fēng)濕性疾病、肝硬化、肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程。1992年美國(guó)的Fox et al[16]首先發(fā)現(xiàn)肝螺桿菌與A/J小鼠肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Chen[17]發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者H pylori感染率明顯高于健康人，且H pylori感染與血氨升高有明顯的相關(guān)性。因此，H pylori感染在肝性腦病發(fā)生中具有重要作用。Nilsson et al[18，19]在原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化患者肝組織中發(fā)現(xiàn)螺桿菌16 SrRNA基因存在，測(cè)序證明與H pylori具有99%同源性。因?yàn)槿祟悓?duì)HP有普遍的易感性，所以近年來人們開始關(guān)注Hp與慢性肝病之間的關(guān)系。

既往流行病學(xué)調(diào)查顯示，維吾爾族人群H pylori感染率（59.8%）高于漢族和哈族[20]。本研究發(fā)現(xiàn)維吾爾族健康人H pylori感染率為60%，而維吾爾族慢性乙型肝炎患者H pylori感染率則高達(dá)85%，高于廣西（31.25%）[21]、江蘇（62.7%）[22]等地區(qū)報(bào)道的漢族慢性乙型肝炎患者。本研究調(diào)查對(duì)象大多來自南疆。南疆氣候干旱、沙塵肆虐，生活環(huán)境較為惡劣，產(chǎn)業(yè)以農(nóng)業(yè)為主。慢性乙型肝炎患者高H pylori感染率是否與生活環(huán)境有關(guān)，有待今后進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，慢性肝炎組與肝硬化組肝組織螺桿菌屬特異性16 sRNA檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同程度肝炎患者肝組織螺桿菌屬特異性16 sRNA檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HBV DNA陽性者與陰性者H pylori感染率亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與既往在漢族人群的研究結(jié)果不一致[11]，其原因可能與地域、種族、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況、宿主基因易感性、H pylori存在不同毒力的菌株等因素有關(guān)。慢性乙型肝炎患者H pylori陽性率高的原因可能與胃黏膜出現(xiàn)病理變化，破壞了胃黏膜屏障，導(dǎo)致黏膜防御能力下降，為細(xì)菌感染創(chuàng)造了條件[22]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在小鼠肝組織分離的螺桿菌是引起嚙齒類動(dòng)物慢性肝炎、肝硬變和肝癌發(fā)生的病因之一[23]。H pylori是否為慢性乙型肝炎和肝硬化發(fā)生的危險(xiǎn)因素仍需要大樣本、長(zhǎng)時(shí)間、前瞻性的研究方能得到更有價(jià)值的結(jié)論。

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（收稿：2015-04-28）

（本文編輯：陳從新）

Helicobacter pylori infection status in Uygur patients with chronic hepatitis B andspecificity 16SrRNA of helicobacter pylori in liver tissues

Wang Xiaozhong，DouYuchang，Wang Yan，etal.Departmentof

Hepatology，Traditional Chinese Medicine Hospital，XinJiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.01.008

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào):2012211A096）

830000烏魯木齊市新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院肝病科（王曉忠，王燕，莊小芳）；吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝病科（竇逾常）第一作者：王曉忠，男，45歲，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:wxz125@sina.com

王燕，E-mail:wy751105@126.com