射頻消融術治療原發性肝癌患者外周血淋巴細胞和NK細胞的變化

趙素斌，張小芳，李守霞

射頻消融術治療原發性肝癌患者外周血淋巴細胞和NK細胞的變化

趙素斌，張小芳，李守霞

目的觀察肝癌患者經射頻消融（RFA）治療后外周血淋巴細胞亞群和NK細胞的變化，探討射頻消融術對肝癌患者免疫功能的影響。方法采用射頻消融治療儀治療原發性肝癌患者66例，采用流式細胞術分析外周血淋巴細胞亞群和NK細胞的變化。結果在RFA治療4 w后，患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值和CD16+CD56+細胞百分比分別為（73.3±11.3）%、（41.3±12.5）%、（1.8±0.5）和（18.9±6.1）%，較RFA治療前的（60.3±9.7）%、（31.5±10.6）%、（1.5±0.6）和（10.1±5.0）%均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；CD8+和CD19+細胞百分比略升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結論原發性肝癌患者細胞免疫功能處于抑制狀態，RFA治療可以激發機體細胞免疫功能，調節淋巴細胞亞群，升高NK細胞，從而改善患者的免疫抑制狀態。

原發性肝癌；射頻消融；淋巴細胞亞群；流式細胞術；NK細胞

【Key words】Hepatocellular carcinoma；Radiofrequency ablation；Flow cytometry；Lymphocyte subsets；NK cells

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前國內外最常見的惡性腫瘤，其死亡率位居各種惡性腫瘤的前列[1]。射頻消融術（Radiofrequency ablation，RFA）是近年來治療原發性肝癌的一種微創技術，具有療效確切、操作簡便、安全性高、組織損傷小、術后并發癥少、可重復操作等優點[2]。射頻消融術在治療腫瘤的同時可以促進機體產生抗腫瘤免疫，提高腫瘤患者的生存期[3，4]。本研究回顧性分析了66例接受RFA治療的原發性肝癌患者在RFA治療前后外周血淋巴細胞亞群和NK細胞的變化，現報告如下：

1　資料與方法

1.1病例來源2012年6月～2014年12月在邯鄲市中心醫院和河北工程大學附屬醫院診治的原發性肝癌患者66例，男40例，女26例；年齡30～79歲，平均年齡（52.6±7.9）歲。符合原發性肝癌的診斷及臨床分期標準[5]。入選標準：腫瘤直徑2～6 cm，腫瘤數目1～4個，無門靜脈或下腔靜脈癌栓，無肝外轉移灶，肝功能Child A級36例，B級30例[6]。所有患者簽署知情同意書。

1.2儀器和試劑使用西門子Acuson Sequoia 512彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為2～10 MHz，配備有探頭穿刺架；使用北京博萊德光電技術開發有限公司生產的多極射頻腫瘤消融系統（RFA-Ⅱ型)；使用美國BD Biosciences公司生產的FACS Cabibur雙激光四色流式細胞儀和Calibrite四色校準微球試劑盒（NO:340486/NO:340487）；鼠抗人CD3+/APC、CD4+/FITC、CD8+/PE、CD16+/PE、CD56+/PE和CD19+/FITC單克隆抗體、溶血素均購自美國BD Biosciences公司。

1.3 RFA治療根據患者病變部位的不同，分別采取仰臥位或者俯臥位，在B超引導下向癌灶內插入針形電極，彩色多普勒超聲觀察腫瘤與周邊臟器關系，確定穿刺部位。建立靜脈通路，肌肉注射度冷丁和安定。根據患者腫塊大小及部位，選擇適當的RFA電極（RFA-1312或RFA-1315），消毒、鋪巾，用無菌袖套包扎穿刺探頭及連接線，尋找最合適的進針線路。將RFA電極針刺入肝臟，到達腫瘤組織內，觀察周圍有無需要避讓的大血管或者膽管、膽囊等，明確針尖位置，將RFA裝置輸入功率調為650 w，最大輸出功率200 w，射頻工作頻率330 kHz，負載阻抗無感電阻50 Ω，負載功率200 w，凝血輸出的最大功率150 w，消融溫度自動控制為（90±2）℃，消融時間為12～20 min，消融范圍≥R（腫塊直徑）+1.5 cm，打開微電極，接通射頻電流后，消融腫瘤。直徑<5 cm的靶腫瘤將全部被強回聲掩蓋，將3～5 cm靶腫瘤及其周邊血管行微波硬化處理。

1.4 T淋巴細胞亞群檢測空腹抽取外周血2～3ml，EDTA-K2抗凝，加入熒光抗體10μl至流式細胞儀專用試管底部，再加入抗凝血100μl，低速混勻3 s，室溫避光靜置15～20 min；加入溶血素2 ml，低速混勻，室溫避光靜置10～12 min，待紅細胞完全裂解后，300 g離心5 min，棄上清液；加入PBS 2 ml洗滌，低速混勻，300 g離心5 min，棄上清液；加入含1%多聚甲醛的PBS 250μl，低速混勻，上機檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+和CD19+細胞百分比。在檢測時設同型對照。

1.5統計學方法應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1臨床效果66例患者接受RFA治療后，隨訪3～10個月，完全緩解6例（9.09%），部分緩解30例（45.5%），病情穩定17例（25.7%）。13例（19.7%）術后相繼出現肝內新發病灶。2.2 RFA治療前后外周血淋巴細胞和NK細胞的變化治療后患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和CD16+CD56+細胞百分比較RFA治療前均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；CD8+和CD19+細胞略升高，但差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

表1　66例患者RFA治療前后外周血淋巴細胞和NK細胞(%，x±s)的變化

3　討論

HCC的發生發展與機體的免疫功能失調密切相關。肝癌患者細胞免疫功能低下，處于免疫抑制狀態，正常的免疫功能遭到破壞[7，8]。近年來，RFA應用廣泛，技術發展迅速，國內外報道明顯增多[9，10]。有研究顯示[11，12]，與手術切除相比，RFA術后腫瘤壞死組織吸收進入血液后，可作為內源性抗原激發機體的抗腫瘤免疫，提高機體抗腫瘤免疫應答。HCC經RFA治療后，可影響淋巴細胞亞群分布，使患者免疫功能得到改善。有報道表明[13]，RFA術后聯合應用干擾素治療，可進一步提高生存率，明顯降低腫瘤轉移及復發率。RFA主要通過3種途徑發揮抗癌作用:①直接殺傷惡性腫瘤細胞，誘導細胞毒性T細胞的產生，增強細胞免疫功能；②經熱療后暴露腫瘤細胞表面抗原或增強腫瘤抗原性，參與腫瘤抗原呈遞，激發細胞免疫；③熱療致使局部產生免疫反應。T細胞介導的細胞免疫是體內免疫系統中主要的抗腫瘤免疫。CD3+細胞為成熟T淋巴細胞表面的膜分子，基本可以反映外周血T淋巴細胞的總量。CD4+細胞為輔助性T淋巴細胞，通過釋放細胞因子激活巨噬細胞、NK細胞，參與抗腫瘤免疫效應。CD8+為細胞毒性淋巴細胞，通過細胞裂解和細胞凋亡直接殺死腫瘤細胞，而保持CD4+/CD8+比值平衡對調節細胞免疫和維持機體的免疫功能有著重要作用。因此，通過檢測淋巴細胞亞群和NK細胞水平，可在很大程度上反映機體的免疫功能。

本研究結果表明，原發性肝癌患者在RFA治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和NK細胞水平與治療前比較均明顯升高，差異有統計學意義；CD8+、CD19+水平略升高，但差異無統計學意義，與有關報道結果基本一致。

RFA治療原發性肝癌，不僅可以消除局部腫塊活性，還可以改善機體免疫抑制狀態，增強機體的免疫功能。淋巴細胞亞群的檢測對于指導腫瘤綜合治療、觀察療效、判斷預后具有重要的臨床意義。

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（收稿：2015-03-30）

（本文編輯：陳宗炳）

Effect of radiofrequency ablation on peripheral blood lymphocytes and NK cells in patients with hepatocellular carcinoma

Zhao Subin，Zhang Xiaogfang，Li Shouxia.Third
DepartmentofSurgery，AffiliatedHospital，HebeiUniversity of

Engineering，Handan 056001，Hebei Province

10.3969/j.issn.1672－5069.2016.01.028

056001河北省邯鄲市河北工程大學附屬醫院普外三科（趙素斌）；邯鄲市中心醫院檢驗科（張小芳，李守霞）

趙素斌，男，主任醫師。主要從事肝膽外科學研究。E-mail:laopoaini777@sina.com

李守霞，E-mail:xiaofang1118@126.com