四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝組織VEGF表達變化*

付指輝，李三強，丁康熙，王秀秀，楊省柯，楊　博，胡景峰，吳秦川

·短篇論著·

四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝組織VEGF表達變化*

付指輝，李三強，丁康熙，王秀秀，楊省柯，楊博，胡景峰，吳秦川

目的研究經(jīng)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達變化及意義。方法將50只小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為對照組（0 w）和實驗組（2、4、6、8 w）。采用腹腔注射CCl4法建立肝纖維化模型，連續(xù)8 w。采用Western blotting法檢測肝組織VEGF表達的變化。結(jié)果給予小鼠藥物后，隨損傷時間的延長，小鼠肝臟損傷并發(fā)生纖維化，并且肝纖維化程度呈逐漸加重的趨勢。在建模的前2 w，試驗組動物肝組織VEGF表達水平迅速升高，在第4 w達到高峰，與第1w和第2w比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；自誘導(dǎo)的第4w開始，肝組織VEGF表達降低，在第8w降至正常水平以下。結(jié)論血管內(nèi)皮生長因子可能參與了四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的形成。

肝纖維化；四氯化碳；血管內(nèi)皮生長因子

【Key words】Liver Fibrosis；Carbon tetrachloride；Vascular endothelial growth factor

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），又名血管通透性因子，其家族成員眾多，是一類重要的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，能提高微小血管的通透性，使血漿部分成分沉積在血管外的基質(zhì)中，以發(fā)揮調(diào)節(jié)血管網(wǎng)的作用[1]。VEGF是目前所知最重要的直接作用于血管內(nèi)皮的生長因子，其在血管中的作用是目前研究最受重視的血管生成因子之一[2]。在制備小鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，隨著注射CCl4時間的延長，肝損害的程度逐漸加重，6~8周后，形成肝纖維化，偶有假小葉形成[3]。在此模型中探索VEGF在肝損傷組織中的表達，有助于了解其分子調(diào)控作用機制。該模型有較明顯的階段性變化[4]。很多研究認為，肝纖維化的形成是多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用的結(jié)果，其中涉及到受損肝細胞的凋亡和肝星狀細胞（HSC）活化等多方面的作用[5]。肝內(nèi)膽管上皮細胞參與星狀細胞的活化及細胞外基質(zhì)的生成等過程，與肝纖維化進程密切相關(guān)[6]。另有研究認為，在人類慢性肝病中肝纖維化是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)病理階段，且此期可逆轉(zhuǎn)[7]。在肝衰竭患者中，若不進行一定的干預(yù)，大部分生存者在2~3年內(nèi)由肝纖維化發(fā)展為肝硬化[8]。所以，對肝衰竭患者進行纖維化的阻斷研究是非常必要的，防治肝纖維化是后肝衰竭時代的重點[9]。本實驗將探討CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷小鼠肝組織VEGF表達的變化。

1　材料與方法

1.1動物、試劑與儀器健康清潔級昆明種雄性小鼠50只，體質(zhì)量18~24 g，由本校實驗動物中心提供，清潔飲水和標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料（我校實驗動物中心）喂養(yǎng)，室溫25℃左右。四氯化碳（CCl4）為天津凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；鼠源性單克隆抗VEGF和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑為上海寶曼生物科技有限公司產(chǎn)品。JY300C基礎(chǔ)電泳儀電源和雙垂直電泳儀（槽）購自北京君易東方電泳設(shè)備有限公司；UV-5200型紫外可見分光光度計由上海元析儀器有限公司生產(chǎn)；H1850R離心機為日本Tome公司生產(chǎn)。

1.2模型制備將50只小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1 w，將其隨機分為5組，每組10只，分別為0 w（對照組）和實驗組（2、4、6、8 w）。將20%CCl4溶于食用油，給予實驗組小鼠5 ml·kg-1腹腔注射，2次/w，連續(xù)8 w，分別于2、4、6和8 w末，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取肝組織，制備成10%勻漿；對照組小鼠腹腔注射等量食用油，方法同上。

1.3肝組織VEGF表達檢測采用Western blotting法，取適量肝組織，以1：10加PBS緩沖液，4℃研磨成勻漿，經(jīng)離心分離制備蛋白樣品。使用分光光度儀測定蛋白含量，采用考馬斯亮藍G250進行蛋白定量，取蛋白液體80 μl上樣，在120 v下SDS-PAGE電泳3 h。剪取硝酸纖維素膜（NC膜），其大小和分離膠大小相同，把膠和膜放入轉(zhuǎn)移緩沖液內(nèi)浸泡20 min，固定轉(zhuǎn)移夾，放入轉(zhuǎn)移槽內(nèi)，以100 mA電流轉(zhuǎn)膜1h，再以穩(wěn)定200 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜成功后，加5%脫脂奶粉-0.1%Tween 20-PBS，4℃封閉膜過夜，取膜用PBS搖擺洗滌3次，每次約5 min，加抗VEGF（1:500）封膜，37℃恒溫箱里孵育80 min，洗滌，加入二抗（1:500）孵育80 min，洗滌。最后，加DAB顯色。用掃描儀將NC膜上的蛋白條帶掃描至計算機，應(yīng)用Gel Pro Analyzer software 4.0軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達值。1.4統(tǒng)計處理計量資料以（x±s）表示，應(yīng)用ANOVA進行顯著性檢驗，組間比較使用Duncan’s test，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析處理，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

在建模的前2 w，試驗組動物肝組織VEGF表達水平迅速升高，在第4 w達到高峰，與第1 w和第2 w比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；自誘導(dǎo)的第4 w開始，肝組織VEGF表達降低，在第8 w降至正常水平以下（圖A、B）。

B：應(yīng)用凝膠分析軟件4.0（Media Cybernetics Inc.，Bethesda，MD）計算的結(jié)果，顯示起初肝組織VEGF表達增強而后減弱，并于8 w低于正常值

3　討論

VEGF表達的變化能反映肝組織血管增生水平。在肝組織損傷初期VEGF表達尤為活躍，但在組織損傷至纖維化嚴重時其表達卻低于正常水平。采用蛋白印跡法在不同時間點檢測VEGF的表達，既客觀地反映受損組織血管增生的程度，又能較直觀地反映小鼠肝纖維化全過程中VEGF的動態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在CCl4誘導(dǎo)的肝組織纖維化過程中的表達先呈現(xiàn)增強趨勢，達到一個峰值后隨之表達減弱。

有研究證明VEGF可使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生纖溶酶原激活系統(tǒng)，以至滲透到血管外區(qū)的血漿蛋白形成纖維蛋白凝塊[10]。另有一些研究顯示機體血TGF-β1水平升高可直接誘導(dǎo)VEGF激活并觸發(fā)HSC活化，轉(zhuǎn)變成肌成纖維樣細胞和成纖維細胞，進而細胞外基質(zhì)（ECM）成分在肝組織內(nèi)異常沉積，促進纖維化的形成[11，12]。本研究結(jié)果顯示，在小鼠肝纖維化早期，VEGF的表達呈增強趨勢，可能在纖維化的進程中起到一定作用。另外，VEGF與flt-1和KDR結(jié)合，導(dǎo)致肝血竇形成[13]，顯著增強肝實質(zhì)細胞的增殖[14]，從而促進肝臟基本結(jié)構(gòu)的重塑。在慢性肝損傷過程中，肝組織經(jīng)歷了較長時間的修復(fù)，增生血管趨于成熟，細胞分泌VEGF減少[15]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，肝組織在反復(fù)受損與修復(fù)而引起的肝纖維化病程中涉及復(fù)雜的分子機制，其中VEGF在肝纖維化前期的高表達增強了組織的修復(fù)，促進了血管的重建，改善了肝臟的血液循環(huán)，但也促進了成纖維蛋白凝塊的形成，與肝纖維化的發(fā)生可能存在一定的關(guān)系。有研究證實，在肝纖維化早期，血管緊張素原mRNA隨著病理分期增加而逐漸增加，但在肝纖維化晚期其水平減少，提示血管緊張素也參與組織的纖維化和重構(gòu)過程[16]，其與VEGF表達的關(guān)系尚未明確。因此，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展所涉及的細胞和分子機制及最后轉(zhuǎn)歸如何，仍需更深入的研究和探索。

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（收稿：2015-05-20）

（本文編輯：陳宗炳）

Expression of vascular endothelial growth factor in liver tissues in mice with carbon tetrachloride-induced liver fibrosis

Fu Zhihui，Li Sanqiang，Ding Kangxi，et al.Key Laboratory，Molecular Medicine of Liver Injury and Repair，Medical

College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan Province，China

10.3969/j.issn.1672－5069.2016.01.020

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：U1204802）；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃資助項目（編號：13HASTIT025）；河南省重點科技攻關(guān)資助項目（編號：122102310030）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究資助重點項目（編號：12B310003）

471003河南省洛陽市河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室

付指輝，男，24歲，大學(xué)本科。研究方向：肝臟損傷與修復(fù)的分子機制研究。E-mail：1970528039@qq.com

李三強，E-mail：sanqiangli2001@163.com