轉移性結直腸癌中應用二代測序技術預測EGFR單抗療效的研究*

王晰程　韋青　高靜　李艷艷　周易　李潔　沈琳

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·臨床研究與應用·

轉移性結直腸癌中應用二代測序技術預測EGFR單抗療效的研究*

王晰程①韋青①高靜①李艷艷①周易②李潔①沈琳①

目的：探索EGFR單抗治療轉移性結直腸癌患者耐藥性相關基因。方法：選取2012年3月至2013年8月在北京腫瘤醫院接受EGFR單抗治療的31例轉移性結直腸癌患者，利用二代測序技術檢測腫瘤組織中與腫瘤發生、發展和EGFR信號傳導通路相關的21個基因，分析其與EGFR單抗療效的關系。結果：Kras基因外顯子2為野生型的晚期結直腸癌的患者31例，接受EGFR單抗單藥三線治療。全組患者中位PFS為89 d，OS為311 d，ORR為16.1%。5例存在Kras第3、4外顯子或者Nras第2、3外顯子突變，均出現首次療效評估PD（中位PFS 31d）。其他突變包括1例PIK3CA突變，PFS為35 d。1例mTOR突變，PFS為91 d。2例患者存在SMAD4突變，PFS分別是58d及59d。1例FBXW7突變，PFS為93d。在26例全Ras基因野生型患者中MLL3、TP53、APC是突變頻率最高的3個基因。MLL3突變比例為92.3%（24/26），TP53為53.8%（14/26），APC為42.3%（11/26）。結論：進行EGFR單抗治療前必須進行Kras及Nras第2、3、4外顯子的檢測，EGFR通路下游信號分子，如PI3KCA、mTOR等可能在EGFR單抗療效上起一定預測作用，針對EGFR外的其他信號通路分子如SMAD4、FBXW7等，需要進一步關注。

轉移性結直腸癌二代測序Ras基因EGFR單抗生物標記物

近年來，EGFR單抗在晚期結直腸癌的治療中取得了較好療效［1］。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是藥物作用的重要靶點之一，活化的EGFR激活下游信號分子從而調節腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、轉移等諸多生物學過程。EGFR抗體通過阻斷EGFR實現了對其下游信號通路的活化抑制，從而達到抗腫瘤目的。CRYSTAL和PRIME研究已證明Kras 第2外顯子野生型的結直腸癌患者可從EGFR單抗聯合化療中獲益，后續的生物標記物研究（包括Kras、Nras 的2、3、4外顯子）報道約45%的結直腸癌患者為Ras基因全野生型，并且Ras基因狀態對EGFR單克隆抗體療效具有預測作用，但在既往研究EGFR單抗單藥治療Kras外顯子2野生型患者的客觀反應率僅10%～20%［2］。除了Ras基因狀態外，是否有其他因素可能會影響EGFR抗體療效尚不得而知。

當今，二代測序技術廣泛應用，這項技術可同時進行上百萬個DNA片段的測序，因此測序時間和測序成本均大幅減少。因為EGFR通路存在多個下游基因，以及其他基因亦有可能影響療效，如曾有文獻報道SMAD4及FBXW7等［3］，故本研究應用二代測序技術，回顧性分析21個基因與EGFR單抗單藥治療轉移性結直腸癌療效的關系。

1　材料與方法

1.1一般資料

研究對象為2012年3月至2013年8月在北京腫瘤醫院接受EGFR單抗（西妥昔單抗或者帕尼單抗）單藥三線治療的31例晚期結直腸癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者。入選標準：1）年齡≥18歲；2）病理組織學或細胞學確診為轉移性結腸或直腸腺癌；3）Kras基因第2外顯子野生型；4）伊立替康、奧沙利鉑和氟尿嘧啶類治療mCRC后疾病進展或無法耐受；5）既往未接受抗EGFR治療。31例患者簽署知情書，其腫瘤組織行二代測序及進一步數據分析。全組31例包括男性19例，女性12例；中位年齡54（30～78）歲。原發部位：結腸癌18例，直腸癌13例。轉移部位包括肝轉移17例，其他部位轉移14例，包括腹腔、盆腔、骨、淋巴結轉移等，其中25例患者存在3個以上部位轉移（表1）。每8周或者研究者考慮疾病進展時進行療效評估。

表1　31例晚期結直腸癌患者基本特征Table 1　Baseline characteristics of 31 patients

1.2方法

1.2.1基因檢測基因芯片包含共21個基因，入選標準：1）其他Ras基因；2）結直腸癌中EGFR通路上已知發生突變的基因：PIK3CA、mTOR、AKT、MEK、ERK、RAF、EGFR、MET、PTEN；3）已報道過與EGFR單抗治療耐藥相關的基因：SMAD4、FBXW7；4）結直腸癌發生發展中重要的基因：MLL3、MLL2、TGFBR2、 FGFR2、TP53、APC、CTNNB1、NOTCH1、GNAS、ADAM29［4-10］（表2）。由病理科醫師復核HE染色，標記出腫瘤含量最高的區域-腫瘤組織＞50%。從甲醛固定的石蠟切片中提取腫瘤DNA，并將其打斷，擴增，從而建立含目標基因的全基因組文庫，然后利用液相捕獲試劑盒（北京基因科技有限責任公司）將樣本的目標基因捕獲，后利用Illumina HiSeq2000進行高通量測序，平均深度不小于200X，進而分析出21個基因的所有突變信息。對照1 000例基因組數據庫、ESP6500正常人數據、1 000 inhouse正常人數據庫，同時關聯HGMD專業版數據庫看位點是否被報道過；并利用SIFT、Polyphen、MutationTaster 3個軟件預測突變致病性，用GERP預測位點在各個物種間的保守性等分析。所有的31例標本均由邁基諾（北京）公司進行檢測。根據以下條件進行數據篩選：1）選擇正常對照中未出現的突變；2）篩除同義突變；2）篩除突變頻率低于0.1；3）篩除覆蓋深度低于5X；4）篩除出現在千人基因組計劃中的單核苷酸多態性。

1.2.2治療方案西妥昔單抗400 mg/m2首次，之后每次滴注250 mg/m2，1次/周。帕尼單抗6 mg/m2·次，每2周重復1次。治療持續至病情進展或患者不能耐受為止。若發生3～4級不良反應，治療停止直至恢復，最長停止4周。相同不良反應再次出現，則減量20%。療效評價按照RECIST1.1版標準，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）和進展（PD）。

1.3統計學分析

采用SPSS 19.0軟件包進行數據分析，計數資料的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。無進展生存期（progression-free survival，PFS）為治療開始直至第1次觀察到疾病進展或者各種原因引起的死亡的時間。總生存期（overall survival，OS）為從治療開始至患者死亡的時間間隔。客觀緩解率（objective response rate，ORR）腫瘤體積縮小≥30%患者的比例。比較兩樣本均數的差異用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1療效評估

31例患者均可評價療效。隨訪至2015年11月15日，總體的中位PFS為89 d。31例患者中29例患者死亡，2例生存隨訪中，中位OS為311 d（圖1）。31例患者的ORR為16.1%，其中5例Ras突變患者的ORR為0，26例全Ras野生型患者的ORR為19.2%。

圖1　31例晚期結直腸癌患者PFS及OSFigure 1　PFS and OS of 31 patients

2.2二代測序

31例Kras外顯子2均為野生型的患者中有5例分別存在Kras第3、4外顯子或者Nras第2、3外顯子突變（Kras第3外顯子Q61L，第4外顯子A146T；Nras第2外顯子G13D，第3外顯子Q61K、Q61L）。這5例患者均在首次療效評估或者出現臨床癥狀時提前評效為PD，中位PFS為31（30～42）d。對剩余的26例Ras全野生的患者進行進一步分析，共有14個基因發生突變。MLL3、TP53、APC是突變頻率最高的3個基因；EGFR通路下游的PI3KCA及mTOR各有1例患者存在基因突變，PIK3CA突變患者最佳療效為PD，PFS為35d。mTOR突變患者最佳療效為SD，PFS為91d。SMAD4突變的2例患者中1例最佳療效為SD，另1例最佳療效為PD，PFS分別是58d及59d，1例出現FBXW7突變的患者最佳療效為SD，PFS為93d（圖2）。

圖2　26例Ras野生型的晚期結直腸癌患者二代測序結果Figure 2　Next-generation sequencing results of 26 Ras wild-type patients

3　討論

本研究檢測樣本因來自2013年以前，當時國際上推薦僅檢測Kras第2外顯子。隨后有多項研究均發現Nras第2、3、4外顯子突變或Kras第3、4外顯子均是預測EGFR單抗治療耐藥的指標［11-13］。如PRIME研究對比帕尼單抗+FOLFOX4及單獨FOLFOX4治療后的療效。回顧性地檢測除Kras基因外顯子2以外，Kras基因的第3和4外顯子和Nras基因的第2～4外顯子有無突變，并發現了17%的患者帶有KRAS第2外顯子以外的突變。該17%患者的OS數據顯示其并不能從EGFR抗體治療中獲益。而國內患者Ras基因狀態是否與EGFR抗體相關還有待進一步驗證［14］。本研究入組的31例患者均為Kras第2外顯子野生型，通過2代測序發現有5例存在Nras第2、3外顯子突變或Kras第3、4外顯子突變。且這5例患者治療反應性均較差，中位PFS僅31d，進一步支持Ras基因突變型患者不能從EGFR單抗治療中獲益。此外本研究發現非Kras顯子2以外的Ras突變率為15.2%（5/31）也與PRIME研究基本吻合。

ASPECCT臨床試驗中帕尼單抗組中位疾病進展時間（median time to treatment failure）是3.4個月，西妥昔單抗組是3.3個月［14］。因為本研究中部分患者在EGFR抗體治療后仍接受了多線治療可能會影響期OS，故本研究著重關注療效差ORR和PFS＜100 d患者的基因狀態。由于Ras基因突變是較明確的耐藥因素，故除外5 例Ras突變的患者后，分析了剩余26例Ras野生型患者的基因譜狀態，發現MLL3、TP53、APC是突變人數最多的3個基因，未見與ORR和PFS呈相關性。TP53和APC突變患者的頻率比例較高，分別是53.8%和42.3%，這與既往研究基本吻合［15-16］。但在結直腸癌中較少被研究的MLL3基因，有24例（92.3%）患者存在突變，明顯高于TP53及APC的突變概率。既往一項大規模對乳腺癌和結腸癌中13 000余個編碼蛋白的基因的檢測工作中，發現了腸癌中69個“可能的”癌癥基因（candidate cancer genes），其中許多未報道與癌癥有關聯［17］。這些基因編碼涉及細胞黏附、信號轉導以及轉錄調節等蛋白，此項研究認為MLL3是結直腸癌中與轉錄相關的基因。因此MLL3是否和TP53及APC一樣與結直腸癌的發生發展相關也需要進一步關注。

EGFR通過激活下游信號通路而參與細胞的生長、增殖、分化和遷移等生理過程。已有研究認為MAPK及PI3K通路中的基因，如Braf、PI3KCA或者PTEN可能參與到耐藥機制中［18］。本研究發現1例患者存在PIK3CA突變，另1例患者存在mTOR突變，這2例患者治療反應性均不佳，PFS分別為35d及91d。有研究［19］統計了結直腸癌EGFR通路上基因突變情況，有14.5%（108/743）的患者存在PIK3CA突變，對EGFR單抗+化療的應答率較低，中位PFS及OS均較短。然而Tol等［20］認為無論是單獨還是聯合使用PIK3CA突變、PTEN表達缺失等指標，對西妥昔單抗療效均無預測作用。所以仍需更多數據驗證PIK3CA突變在EGFR單抗治療中的預測作用。另外，雖然本研究檢測到1例患者存在mTOR突變，PFS為91d，但是截至目前，尚無證據證實mTOR與EGFR單抗治療敏感性的關系。在PFS大于100d的12例患者中未發現EGFR通路相關基因突變。另外，許多研究認為Braf突變和PTEN表達缺失均可能與EGFR單抗療效差相關［21-24］。但在本組31例患者中，均未檢測到其突變，可能與樣本量較少有關。

此外，既往研究報道SMAD4及FBXW7突變可能是對抗EGFR單抗不敏感的指標［3］。本研究發現了2 例SMAD4及1例FBXW7突變，SMAD4突變的2例患者療效也較差（PFS分別為58d和59d，最佳療效評估分別為PD及SD），FBXW7突變的患者PFS為93d，最佳療效為SD。FBXW7基因突變在結直腸癌中的突變率是11%～12%［25-26］。FBXW7的低表達與預后差相關［27］。作為泛素蛋白酶體降解途徑的重要識別因子之一，FBXW7作用的很多底物均為癌基因［28］。它已經被證明是一種抑癌基因，其突變和缺失會導致染色體的不穩定甚至腫瘤的發生。SMAD4是TGFβ信號通路的中心分子，所有生物學效應均是SMAD4與不同的SMADs蛋白相互作用的結果［29］。本研究檢測結果為這假說提供了進一步的證據。

本項研究存在回顧性、樣本量較少、基因芯片無法覆蓋所有和腸癌相關基因等不足。但是通過本研究，進一步驗證對Kras及Nras第2、3、4外顯子的突變檢測是進行EGFR單抗治療的必需。同時，EGFR通路下游信號分子（PIK3CA和mTOR）可能在EGFR單抗療效預測上起一定作用。SMAD4/FBXW等基因突變是否與EGFR單抗療效相關，值得進一步關注。MLL3、TP53和APC存在高頻突變，這些突變也提示結直腸癌的發生發展可能是多種因素共同調控的結果。

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（2015-12-22收稿）

（2016-01-30修回）

（編輯：周曉穎校對：邢穎）

王晰程專業方向為消化道腫瘤臨床與基礎研究。

E-mail：xicheng_wang@hotmail.com

Using next-generation sequencing technology to evaluate biomarkers associated with anti-EGFR efficacy in metastatic colorectal cancer

Xicheng WANG1，Qing WEI1，Jing GAO1，Yanyan LI1，Yi ZHOU2，Jie LI1，Lin SHEN1
Correspondence to：Lin SHEN；E-mail：lin100@medmail.com.cn
1Department of Gastroenterological Oncology，Peking University Cancer Hospital&Institute，Key laboratory of Carcinogenesis and Translational Research（Ministry of Education/Beijing），Beijing 100142，China；2Department of Medical Oncology，The Third Hospital of Dalian，Dalian 116031，China This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81101878）

Objective：To explore genes associated with sensitivity to anti-EGFR therapy.Methods：From March 2012 to August 2013，31 metastatic colorectal cancer patients in Peking University Cancer Hospital&Institute were treated with anti-EGFR mono-therapy.A total of 21 genes associated with oncogenesis，metastasis，and EGFR signaling pathway were profiled in these 31 patients by using targeted next-generation sequencing technology.Results：A total of 31 patients with Kras exon 2 wild-type received anti-EGFR therapy as third-line treatment.Among these patients，the median progression-free survival（PFS）was 89 days，overall survival was 311 days，and objective response rate was 16.1%.Five cases harbored Kras exons 3/4 or Nras exons 2/3 mutations.These five Ras mutation patients showed disease progression during the first evaluation with 31-day PFS.One PIK3CA mutation case exhibited disease progression during the first evaluation（PFS 35 days），and one case showed mTOR mutation with 91-day PFS.The PFS of two cases with SMAD4 mutation were 58 and 59 days，whereas that of the case containing FBXW7 mutation was 93 days.Among the 26 Ras wild-type patients，MLL3，TP53，and APC were the three genes with the highest mutation frequencies of 92.3%（24/26），53.8%（14/26），and 42.3%（11/ 26），respectively.Conclusion：Extended Ras analysis（including Kras and Nras exons 2/3/4）is recommended for patients who are candidates for anti-EGFR therapy.Mutations in the downstream effectors of the EGFR signaling pathway，such as PI3KCA and mTOR，may also have a predictive role in anti-EGFR therapy.Mutations beyond the EGFR pathway such as FBXW7 and SMAD4 may be associated with anti-EGFR efficacy and deserve further attention.

metastatic colorectal cancer，next-generation sequencing，Ras gene，EGFR mono-antibody，biomarker

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.04.435

①北京大學臨床腫瘤學院，北京腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所消化腫瘤內科，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室（北京市100142）；②大連市第三人民醫院腫瘤內科

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81101878）資助

沈琳lin100@medmail.com.cn