臨床分離非傷寒沙門菌耐藥性及對頭孢曲松耐藥機(jī)制

師 偉，夏琳林，劉曉霞，韓雙羽，楊 杰，趙 展，王玉寶（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所，天津 300211）

論著

臨床分離非傷寒沙門菌耐藥性及對頭孢曲松耐藥機(jī)制

師 偉，夏琳林，劉曉霞，韓雙羽，楊 杰，趙 展，王玉寶
（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所，天津 300211）

目的 了解臨床分離非傷寒沙門菌（NTS）耐藥情況及對頭孢曲松的耐藥機(jī)制，為防治NTS感染與合理使用抗菌藥物提供依據(jù)。方法 選取2014年5—10月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腸道門診急性腹瀉患者糞便標(biāo)本分離的108株NTS，對其進(jìn)行藥敏試驗；對頭孢曲松不敏感的NTS進(jìn)行血清學(xué)分型、多位點序列分型（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型以及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和AmpC基因檢測。結(jié)果 108株NTS對11種抗菌藥物的單藥耐藥率為49.07%（53株），多重耐藥率為17.59%。對萘啶酸、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松和厄他培南的敏感率依次為61.11%、66.67%、68.52%、97.22%和100.00%。共檢出3株NTS對頭孢曲松不敏感，其中2株為ST11型腸炎血清型（Sa8709、Sa8771），1株為ST34型鼠傷寒血清型（Sa8763）。PFGE聚類分析顯示，Sa8709和Sa8771菌株相似度較高（91.70%），但與Sa8763菌株相似度較低，為55.80%；Sa8709菌株攜帶CTX-M基因，Sa8771菌株攜帶CTX-M和TEM基因，Sa8763菌株攜帶OXA基因。結(jié)論 該地區(qū)臨床分離NTS對氟喹諾酮類抗菌藥物敏感率不高，出現(xiàn)了攜帶ESBLs基因的多重耐藥菌株。

非傷寒沙門菌；多位點序列分型；脈沖場凝膠電泳；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；氟喹諾酮；抗藥性，微生物；耐藥性

［Chin J Infect Control，2016，15（4）：217—221］

全球非傷寒沙門菌（nontyphoidal Salmonella，NTS）感染呈現(xiàn)普遍上升趨勢，美國每年約有100萬例患者感染NTS［1］，我國每年因NTS感染所致急性腹瀉患者約823.5萬例［2］。NTS主要引起急性胃腸炎，約6%的患者可發(fā)展為敗血癥而威脅生命［3］。NTS是細(xì)胞內(nèi)生存菌，某些抗菌藥物雖然對其有體外活性但無臨床療效，可供臨床選用的藥物主要包括氨芐西林、復(fù)方磺胺甲口惡唑、氟喹諾酮類（FQs）和頭孢曲松等。近年來，NTS對抗菌藥物耐藥率明顯上升，美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）將NTS耐藥威脅列為“嚴(yán)重”級別。近期國內(nèi)少有臨床分離NTS對抗菌藥物耐藥監(jiān)測報道，本研究開展臨床分離NTS的耐藥監(jiān)測，以及對頭孢曲松耐藥機(jī)制的初步探討，為NTS感染防治和臨床合理使用抗菌藥物提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株來源 選取2014年5—10月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腸道門診的急性腹瀉患者糞便標(biāo)本分離的108株非重復(fù)NTS。按照《食品衛(wèi)生檢驗方法微生物學(xué)部分》GB/4789-2010中腸道致病菌檢驗方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，API 20 E試紙條進(jìn)行生化鑒定。

1.2藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2013年抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中K-B紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗［4］。藥敏紙片包括氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方磺胺甲口惡唑、鏈霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、頭孢曲松、頭孢他啶和厄他培南11種抗菌藥物。厄他培南藥敏紙片由賽默飛世爾科技有限公司提供，其余均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。質(zhì)控菌株為本研究所保存的大腸埃希菌ATCC25922。多重耐藥［5］為對3類或3類以上抗菌藥物耐藥。

1.3對頭孢曲松不敏感NTS菌株的相關(guān)檢測

1.3.1血清學(xué)分型 沙門菌血清診斷試劑盒為丹麥國立血清研究所產(chǎn)品，參照試劑盒說明書步驟和

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物學(xué)檢驗沙門菌方法（GB/T4789.4-2010），根據(jù)測定得到的抗原結(jié)果，比對Kauffmann-White抗原表確定菌株的血清型［6］。

1.3.2 脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型 PFGE分型按照美國CDC推薦的分型方案進(jìn)行，PFGE成像結(jié)果采用BioNumerics軟件進(jìn)行聚類分析。分型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為布倫登盧普沙門菌H9812。

1.3.3多位點序列分型（MLST） 將MLST網(wǎng)站（http：//mlst.ucc.ie）上公布的沙門菌屬的7個管家基因（thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD、dnaN）作為本實驗的目的基因，采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［6］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，測序由英濰捷基技術(shù)有限公司進(jìn)行。測序結(jié)果提交至MLST網(wǎng)站，得到菌株的等位基因譜和對應(yīng)的ST分型。

1.3.4超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和AmpC基因檢測 選取對頭孢曲松不敏感的NTS菌株（Sa8709、Sa8771、Sa8763）和敏感菌株（Sa8690）進(jìn)行ESBLs基因（CTX-M、TEM、SHV、OXA）及AmpC基因（CMY、ACC進(jìn)行）檢測，引物序列、PCR反應(yīng)體系和條件參照文獻(xiàn)［7］。對PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，以確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和準(zhǔn)確性，用敏感菌株Sa8690作為陰性質(zhì)控。合成引物與測序公司同前。

2　結(jié)果

2.1NTS基本情況 共分離108株非重復(fù)NTS，其中88株來自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，20株來自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院。患者平均年齡36.6（17～88）歲；男性66例（61.11%），女性42例（38.89%）。

2.2 NTS藥敏結(jié)果 108株NTS對11種抗菌藥物的單藥耐藥率為49.07%（53/108），多重耐藥率為17.59%（19/108）。對萘啶酸、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松和厄他培南的敏感率依次為61.11%、66.67%、68.52%、97.22%和100.00%。詳見表1。

表1　108株NTS對11種抗菌藥物的藥敏結(jié)果Table 1 Antimicrobial susceptibility testing results of 108 NTS isolates to 11 kinds of antimicrobial agents

2.3對頭孢曲松不敏感的NTS菌株

2.3.1基本情況 共有3株NTS對頭孢曲松不敏感，均為MDR菌株，其中2株耐藥菌株為Sa8709 和Sa8771，1株中介為Sa8763。Sa8709菌株分離自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，對氨芐西林、萘啶酸、頭孢曲松耐藥，對環(huán)丙沙星中介耐藥；Sa8771菌株分離自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，對氨芐西林、鏈霉素、萘啶酸、頭孢曲松、頭孢他啶耐藥，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星中介；Sa8763菌株分離自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，對頭孢曲松中介，對氨芐西林、萘啶酸、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、四環(huán)素耐藥。

2.3.2血清學(xué)分型結(jié)果 耐藥菌株Sa8709和Sa8771均為腸炎血清型（Salmonella enterica），中介耐藥菌株Sa8763為鼠傷寒血清型（typhimurium Salmonella）。

2.3.3PFGE分型結(jié)果 聚類分析顯示，3株對頭孢曲松不敏感NTS菌株的PFGE帶型不同，Sa8709和Sa8771菌株相似度較高，為91.70%；Sa8709和Sa8771菌株與Sa8763菌株相似度較低，為55.80%。見圖1。

圖1　3株對頭孢曲松不敏感NTS PFGE聚類分析圖譜Figure 1 Clustering analysis of PFGE of 3 non-ceftriaxone-susceptible NTS isolates

2.3.4MLST結(jié)果 Sa8709、Sa8771和Sa8763菌株均能擴(kuò)增出預(yù)期長度的7個管家基因DNA片段。見圖2。將測序結(jié)果提交至MLST網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，顯示Sa8709和Sa8771菌株的7個管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA的等位基因譜依次均為5、2、3、7、6、6、11，對應(yīng)的MLST分型均為ST11型；Sa8763菌株的等位基因譜依次為10、19、12、9、5、9、2，對應(yīng)的分型是ST34型。

圖2　3株對頭孢曲松不敏感NTS 7個管家基因PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 2 Electrophoresis results of PCR products of 7 housekeeping genes in 3 non-ceftriaxone-suscep—tible NTS isolates

2.3.5ESBLs和AmpC基因檢測結(jié)果 Sa8709、Sa8771菌株CTX-M基因，Sa8771菌株TEM基因，Sa8763菌株OXA基因均擴(kuò)增到符合預(yù)期長度的基因片段。測序結(jié)果顯示，Sa8709、Sa8771菌株的CTX-M基因片段序列與腸炎沙門菌Hd63的CTX-M序列（GenBank NO.NG036027）相似性為99%；Sa8771菌株的TEM基因片段序列與腸炎沙門菌D7795的TEM序列（GenBank NO.LN879484）相似性為100%；Sa8763菌株OXA基因片段序列與鼠傷寒沙門菌ST0653的OXA序列（GenBank NO.KT334335）相似性為98%。陰性對照Sa8690菌株未擴(kuò)增出上述任何耐藥基因。見圖3。

圖3　ESBLs和AmpC基因PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 3 Electrophoresis results of PCR products of ESBLs and AmpC genes

3　討論

NTS與傷寒沙門菌不同，主要引起自限性胃腸炎，但是部分患者可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如敗血癥、局灶感染等，幼兒、老人、免疫功能低下以及有血管內(nèi)植入物等患者是高風(fēng)險人群。美國每年因NTS感染導(dǎo)致約2萬例住院患者，以及近400例患者因此而死亡［1］。FQs被認(rèn)為是經(jīng)驗治療NTS感染非常有效的藥物，但是在某些地區(qū)耐藥率明顯上升［3］。近年來，發(fā)現(xiàn)若NTS對萘啶酸耐藥，會導(dǎo)致FQs臨床治療失敗或者反應(yīng)延遲，故FQs不適于萘啶酸耐藥的NTS感染［4］。2013年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)指出，萘啶酸耐藥可用于預(yù)測FQs耐藥或者敏感性降低，并且為了更好地反映臨床療效，采用新的標(biāo)準(zhǔn)判定環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對NTS的敏感性，部分既往判斷為敏感的菌株按照新標(biāo)準(zhǔn)會判定為中介［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)NTS對萘啶酸的耐藥率達(dá)38.89%，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的敏感率僅為68.52%和66.67%。國內(nèi)多個地區(qū)前期報道顯示，NTS對萘啶酸的耐藥率較高，約為45%～85%［8—10］。以上數(shù)據(jù)提示我國臨床NTS對FQs敏感性降低的菌株比例較高，并且涉及多個地區(qū)，因此應(yīng)考慮重新評估FQs在我國是否仍適用于經(jīng)驗治療NTS感染。

頭孢曲松是治療NTS感染非常重要的替代藥物，雖然臨床分離NTS對頭孢曲松耐藥比率仍較低，但是呈現(xiàn)上升趨勢。2014年CHINET［11］對來自17所教學(xué)醫(yī)院的菌株檢測發(fā)現(xiàn)，腸炎血清型沙門菌和鼠傷寒血清型沙門菌對頭孢曲松的耐藥率分別為10.60%和11.40%。NTS對頭孢曲松耐藥的主要機(jī)制是攜帶ESBLs基因（CTX-M、TEM、SHV和OXA等）和/或AmpC基因（CMY和ACC等）［12—14］。PCR擴(kuò)增和序列分析表明，本研究中3株對頭孢曲松耐藥的NTS，其中1株攜帶CTX-M基因，1株同時攜帶CTX-M和TEM基因，1株中介菌株攜帶OXA基因，均屬于ESBLs基因；未檢出AmpC基因。值得關(guān)注的是，腸炎型和鼠傷寒型NTS是引起人體感染的主要血清型，并且常導(dǎo)致暴發(fā)。本地區(qū)曾有腸炎血清型ST11型沙門菌造成感染暴發(fā)的報道［5］。本研究中對頭孢曲松耐藥或中介菌株為腸炎型和鼠傷寒型NTS，不僅對頭孢曲松不敏感，而且對FQs耐藥或中介，若引起感染暴發(fā)，則治療將更為困難，危害更加嚴(yán)重。

PFGE是目前細(xì)菌基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而MLST分型則能夠反映菌株之間的進(jìn)化和親緣關(guān)系。本研究中對頭孢曲松耐藥NTS菌株（Sa8709、Sa8771）為腸炎血清型，其PFGE譜型不同，屬于不同的克隆株，但二者均為腸炎血清型ST11型，說明在遺傳學(xué)上有關(guān)聯(lián)，而且PFGE譜型相似度較高為91.70%，提示可能由同一克隆株進(jìn)化而來。

本地區(qū)臨床分離NTS菌株對復(fù)方磺胺甲口惡唑、氯霉素的敏感率較高，可能與這些藥物較少使用有關(guān)。近年來，阿奇霉素被發(fā)現(xiàn)對NTS有較好的臨床療效，但是已開始有耐藥菌株的報道。特別強(qiáng)調(diào)的是，NTS感染大部分為自限性，僅高危患者才需要使用抗菌藥物治療，臨床醫(yī)生應(yīng)把握適宜指征。NTS感染主要是食源性，畜牧養(yǎng)殖業(yè)也應(yīng)該盡量減少使用不必要的抗菌藥物，其為抗菌藥物合理使用中不可缺少的組成部分。

綜上所述，本地區(qū)臨床分離NTS對FQs敏感率不高，出現(xiàn)了攜帶ESBLs基因的MDR菌株，應(yīng)高度重視抗菌藥物在各個行業(yè)的合理應(yīng)用，并需要更為廣泛深入的監(jiān)測與研究。

致謝：感謝中國疾病預(yù)防控制中心腹瀉病研究室和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染性疾病科對本研究提供的大力支持和幫助。

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（本文編輯：劉思娣）

Antimicrobial resistance and mechanisms of ceftriaxone resistance in clini-cally isolated nontyphoidal Salmonella

SHI Wei，XIA Lin-lin，LIU Xiao-xia，HAN Shuang—yu，YANG Jie，ZHAO Zhan，WANG Yu-bao（Institute of Infectious Diseases，The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin300211，China）

Objective To investigate antimicrobial resistance and ceftriaxone resistance mechanisms in clinically isolated nontyphoidal Salmonella（NTS），and provide evidence for the prevention and control of NTS infection and rational use of antimicrobial agents.Methods 108 NTS isolates were isolated from stool specimens of outpatients with acute diarrhea in the Second Hospital of Tianjin Medical University and Tianjin Medical University General Hospital from May to October of 2014，NTS were performed antimicrobial susceptibility testing；non-ceftriaxone-susceptible isolates were typed by serological，multilocus sequence（MLST），and pulsed-field gel electrophoresis （PFGE）methods，extended-spectrumβ-lactamase（ESBL）detection and AmpC genes were detection.Results Among108 NTS isolates，mono-drug resistance rate to 11 antimicrobial agents was 49.07%（n=53），multidrug resistance rate was17.59%.Susceptibility rates to nalidixic acid，levofloxacin，ciprofloxacin，ceftriaxone，and ertapenem were 61.11%，66.67%，68.52%，97.22%，and 100.00%respectively.Three non-ceftriaxone-susceptible NTS isolates were detected，2 were ST11 Salmonella enterica serotype（Sa8709，Sa8771），1 was ST34 Salmonella typhimurium serotype（Sa8763）.Cluster analysis of PFGE revealed that Sa8709 was highly similar to Sa8771 strains（91.70%），but the similarity to Sa8763 was low（55.80%）；Sa8709 strain carried CTX-M gene，Sa8771 strain carried CTX-Mand TEMgenes，Sa8763 strain carried OXAgene.Conclusion Clinically isolated NTS in this area are low resistant to fluoroquinolones，multidrug resistant strains carrying ESBLs have emerged.

nontyphoidal Salmonella；multilocus sequence typing；pulsed-field gel electrophoresis；extended-spectrumβ-lactamase；fluoroquinolone；drug resistance，microbial；drug resistance

R181.3+2 R378.2

A

1671—9638（2016）04—0217—05

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.001

2015—12—25

天津市衛(wèi)生局科研基金資助項目（2013KZ112）

師偉（1986—），男（漢族），河北省張家口市人，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥及致病機(jī)制研究。

王玉寶 E-mail：wyb2046@163.com