不同施灸方向對寒凝血瘀證大鼠血管收縮與舒張因子的影響

王　寬　呼雪慶　黃玉薩　王清然　高春鵬　劉　民　劉慧榮

.論著.

不同施灸方向對寒凝血瘀證大鼠血管收縮與舒張因子的影響

王寬呼雪慶黃玉薩王清然高春鵬劉民劉慧榮

目的 觀察不同施灸方向對寒凝血瘀證模型大鼠血管收縮與舒張因子的影響.方法選取清潔級Wistar大鼠32只,隨機分組:正常組(A)、模型組(B)、順經灸組(C)和逆經灸組(D),每組8只.在成功建立大鼠寒凝血瘀證模型后,對順經灸和逆經灸兩組大鼠實施不同操作方向的艾灸治療,即沿膀胱經分別行"由上至下"及"由下至上"的單向反復操作,共治療14天.治療結束后,各組大鼠腹主動脈取血,采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠血漿內皮素-1(endothelin-1,ET-1)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的濃度.按照大鼠癥狀和體征量化評分表對大鼠的活動、毛發、大便、小便及脈絡瘀血等情況進行相應評分,并最終計算大鼠寒凝血瘀的程度.結果 與正常組比較,模型組大鼠癥狀和體征量化積分及血漿ET-1濃度均明顯升高(P<0.05),NO濃度明顯下降(P<0.05);與模型組比較,順經灸組和逆經灸組大鼠癥狀和體征量化積分及血漿ET-1濃度均明顯下降(P<0.05),NO濃度均明顯升高(P<0.05);順經灸組大鼠癥狀和體征量化積分及血漿NO濃度較逆經灸組均有明顯差異(P<0.05).結論 順經灸與逆經灸大鼠足太陽膀胱經均能明顯促進寒凝血瘀證大鼠血漿NO的釋放,抑制血漿ET-1的釋放,改善大鼠寒凝血瘀癥狀,且順經灸的治療效應稍優于逆經灸.

艾灸; 方向; 寒凝血瘀證; 血漿內皮素-1; 一氧化氮

艾灸療法是中國傳統中醫療法中的一項重要組成部分,是經過悠久歷史沉淀的頗具中醫特色的外治法之一.正是由于艾灸具有預防保健、強健體魄、延緩衰老以及延年益壽的功效,使得艾灸被廣大的民眾所熟識,甚至遠揚國外,相關灸法的研究也受到國內外學者的高度重視.寒凝血瘀證是中醫臨床常見證型,艾灸活血化瘀的顯著作用,可作為治療寒凝血瘀證的一項優勢療法.本實驗基于古代醫籍中有關艾灸方向的論述,選取寒凝血瘀證動物模型,觀察不同施灸方向對寒凝血瘀證大鼠血管收縮和舒張因子的影響,以期進一步規范臨床艾灸操作流程,完善艾灸的相關效應機制,提高艾灸療效.

1　材料與方法

1.1實驗動物

Wistar大鼠32只,雌雄各半,體質量(200±20)g,購自上海中醫藥大學醫學實驗動物中心[許可證號:SCXK(滬)2012-0002],適應性喂養7天.

1.2試劑及儀器

0.1%鹽酸腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司生產,批號:W131106).醫用紅外耳式體溫計:江蘇魚躍醫療設備股份有限公司;ELISA試劑盒:武漢基因美生物科技有限公司;酶標儀:芬蘭(Labsystems Multiskan MS)公司;洗板機:芬蘭(Thermo Labsystems)公司;離心機:微量高速離心機(國產);移液器:吉爾森P型移液器(Pipetman);培養箱:隔水式恒溫培養箱(國產);其他所需耗材均為國產.

1.3動物分組及模型制備

將32只大鼠隨機分為正常組、模型組、順經灸組和逆經灸組,每組8只.模型組、順經灸組和逆經灸組寒凝血瘀證大鼠模型參照相關文獻[1-4]制備.具體方法為:采用背部皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素的方式,按0.3 mL/kg標準計算注射量,用生理鹽水稀釋5倍后分2次注射.第1次注射后1小時,將大鼠置于4～6℃冰水中冰浴4分鐘,1小時后進行第2次注射,共持續4周,前2周造模每天進行,后2周造模隔天進行,且后2周只冰浴不注射鹽酸腎上腺素.正常組大鼠除稱重均不作其他任何處理.

1.4艾灸治療

本實驗選取大鼠背部脊柱兩旁膀胱經連線的經段("大椎"至"十七椎下"),大鼠膀胱經連線距背正中線0.9～1.2 cm.具體定位:大椎:第七頸椎與第一胸椎間,背部正中;十七椎下:第6腰椎橫突的前內側.在大鼠寒凝血瘀證模型制備成功后,即開始進行艾灸治療.順經灸組治療時艾條移動的方向與逆經灸組彼此相反,且均為單向操作.治療所用艾條均為自制艾條(長約15 cm、直徑約1 cm),施灸時,艾條距施術部位皮膚1～2 cm,移動均勻緩慢(單向移動一次約3～5秒),順經灸和逆經灸兩組大鼠的艾灸操作分別按照"順膀胱經循行的方向"和"逆膀胱經循行的方向"進行,每天10分鐘,共治療14天.治療期間,正常組大鼠不作處理,模型組大鼠與兩個治療組行同樣抓取動作.

1.5大鼠癥狀和體征觀察

參照相關文獻及中醫證候研究[3,5-7],制定寒凝血瘀證大鼠癥狀和體征量化評分表,詳見表1.通過觀察大鼠活動、毛發、大便、小便及脈絡瘀血等一般情況,按照大鼠癥狀和體征量化評分表對其進行相應評分,并最終計算大鼠寒凝血瘀的程度.評分每周1次,共計6次.

1.6大鼠耳溫檢測

用紅外耳式體溫計分別于造模第1天、8天、16天、24天和28天對大鼠耳溫進行檢測.

1.7大鼠血漿內皮素-1及一氧化氮濃度檢測

治療結束后,大鼠麻醉,行腹主動脈取血,抗凝處理,采用ELISA法檢測大鼠血漿內皮素-1 (endothelin-1,ET-1)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的濃度.

1.8統計學處理

采用SPSS 18.0統計學分析軟件,資料以均數±標準差表示,大鼠癥狀和體征量化積分(第28天)以及大鼠血漿ET-1、NO濃度均同時滿足正態性和方差齊性條件,故采用方差分析;而大鼠癥狀和體征量化積分(治療第7、14天)及大鼠耳溫不同時滿足正態性和方差齊性條件,采用完全隨機設計多個樣本間的多重比較,以P<0.05為差異有統計學意義.

2　結果

2.1大鼠癥狀、體征量化積分

模型制備過程中,大鼠逐漸表現出畏寒蜷縮、寒戰、毛發枯干無光澤、大便量多質稀甚則不成形、小便清長、口舌暗淡、肛周紫黯等中醫寒凝血瘀的表征.如表2所示,在造模結束時(第28天),與正常組比較,模型組、順經灸組及逆經灸組大鼠癥狀和體征量化積分均明顯升高(P<0.05),且達到寒凝血瘀的重度水平,而三組大鼠癥狀和體征量化積分之間無明顯差異.后經過2周時間的艾灸治療,順經灸和逆經灸兩組大鼠以上寒凝血瘀的表現均有明顯好轉,從表2可以看出,治療結束后,順經灸組和逆經灸組大鼠的癥狀和體征量化積分較模型組均顯著下降(P<0.05),而且順經灸組大鼠的癥狀和體征量化積分較逆經灸組降低更加明顯(P<0.05).

2.2大鼠耳溫變化

正常組大鼠在模型制備過程中耳溫變化不明顯,最低時(36.20±0.17)℃,最高時(36.40±0.11)℃,而模型組、順經灸組和逆經灸組大鼠耳溫變化明顯.隨著模型制備過程的進行,模型組、順經灸組和逆經灸組大鼠耳溫均有"先上升后下降"的變化趨勢(如圖1),在造模結束時,模型組、順經灸組和逆經灸組大鼠耳溫[(35.56±0.13)℃、(35.66±0.34)℃、(35.70±0.25)℃]較正常組明顯降低(P<0.05),且三組大鼠耳溫無明顯差異(P>0.05),詳見表3.

表1　寒凝血瘀證大鼠癥狀和體征量化評分表

表2 各組大鼠癥狀和體征量化積分(±s,分)

表2 各組大鼠癥狀和體征量化積分(±s,分)

注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與順經灸組比較,cP<0.05.

分組n造模階段第7天第14天第21天第28天治療階段第7天第14天00±0.000.00±0.00模型組83.38±1.066.25±1.588.38±1.5110.63±0.92a10.13±0.99a8.88±1.13a順經灸組82.75±0.896.25±0.898.00±1.2011.25±1.28a8.13±0.84a3.63±0.74ab逆經灸組82.87±0.356.75±0.898.87±1.1311.38±0.92a8.50±0.93a5.13±0.84正常組80.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000. abc

表3　各組大鼠耳溫變化(±s,℃)

表3　各組大鼠耳溫變化(±s,℃)

注:與正常組比較,aP<0.05.

分組n造模第1天造模第8天造模第16天造模第24天造模第28天0936.36±0.13模型組836.43±0.0936.41±0.3336.56±0.2836.15±0.1535.56±0.13a順經灸組836.38±0.2336.18±0.2336.45±0.2235.63±0.3335.66±0.34a逆經灸組836.38±0.1336.45±0.2436.33±0.1235.91±0.2435.70±0.25正常組836.40±0.1136.25±0.2636.20±0.1736.35±0. a

圖1　各組大鼠耳溫變化

2.3大鼠血漿ET-1及NO濃度變化

如表4所示,與正常組比較,模型組大鼠血漿ET-1濃度明顯上升(P<0.05),血漿NO濃度明顯下降(P<0.05);與模型組比較,順經灸組和逆經灸組大鼠血漿ET-1濃度顯著下降(P<0.05),血漿NO濃度顯著上升(P<0.05),其中順經灸組大鼠血漿NO濃度水平明顯高于逆經灸組(P<0.05).

表4　各組大鼠血漿ET-1及NO濃度(±s,ng/L)

表4　各組大鼠血漿ET-1及NO濃度(±s,ng/L)

注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與順經灸組比較,cP<0.05.

8112.26±14.62132.60±9.79模型組8131.20±9.88a102.14±7.23a順經灸組8104.13±14.92b136.32±7.49b逆經灸組8108.82±19.48b119.46±6.34 ET-1NO正常組組別n bc

3　討論

寒凝血瘀證主要表現為畏寒肢冷、口唇紫黯、舌暗淡(舌下脈絡瘀曲)、大便量多質稀甚或便溏、小便清長等一系列體征和癥狀,其特點為"寒致瘀".寒邪為陰邪而主收引,寒性凝滯,無論外寒還是內寒,均能導致機體血液運行不暢,而終成血瘀,其病因病機主要為:寒邪侵襲,血得寒則凝,凝則不通,不通即瘀.《諸病源候論》中指出"寒則血結,溫則血消",《素問.調經論》中也有:"氣血者,喜溫而惡寒,寒則泣(澀)而不行,溫則消而去之."這些古文獻不但總結了以上寒凝血瘀證的病因病機,同時又啟示臨床治療寒凝血瘀證的治療原則,即溫通.

艾灸療法是傳統中醫中頗具特色的外治法之一,艾灸具有溫經通脈、活血化瘀、補虛培本等功效,有"灸治百病"之說,對某些病癥的治療效果更是超過了針和藥[8-9].《千金要方灸例》中提到:"凡灸當先陽后陰,言從頭向左而漸下,次后從頭向右而漸下,先上后下."《明堂》中也有:"凡病先灸于上,后灸于下,先灸于少,后灸于多,皆宜審之."可見古代醫家通過大量的臨床實踐總結歸納出了有關艾灸操作的方向和順序,這在當時應該是被認為會影響艾灸療效的關鍵因素.在當代,活血化瘀被公認為是艾灸療法最顯著的作用之一,艾灸活血化瘀的作用機制與改善血液流變學異常,糾正自由基代謝紊亂,調節血管上皮細胞因子,增強機體免疫功能,穩定內環境等有關[10-12].

血管內皮是介于血液和血管壁組織之間的單層扁平上皮,是分割血液和組織的屏障,血管內皮細胞可通過內分泌、自分泌及旁分泌產生一系列血管活性物質,從而發揮調節血管收縮和舒張、防止血小板黏附和血栓形成、調節血管平滑肌細胞增殖以及抑制血管壁炎癥反應等功能.ET和NO均是血管上皮細胞分泌的血管活性物質,是調節心血管功能的重要因子,其中ET被認為是迄今為止最強的縮血管物質,而NO則是內皮細胞產生的最重要的舒血管物質.有研究表明[13-17],艾灸可有效調節血管ET-1及NO水平,保護血管上皮功能.本實驗中寒凝血瘀證動物模型的病機特點可概括為"寒則凝,凝則瘀",模型制備過程中,模擬中醫"寒則血瘀"的發病機制,給予長時間的冷刺激,結合皮下注射鹽酸腎上腺素,大鼠逐漸表現出寒、瘀的表征,在經過長達28天的造模過程后,大鼠的整個機體都表現出瘀的病理狀態,這與中醫的整體觀念是基本相符的,同時也說明制備寒凝血瘀證大鼠模型是成功的,而且具有中醫表征特點.研究結果表明順經灸的治療效果優于逆經灸,這為規范臨床艾灸操作流程提供了一定的實驗依據,不同施灸方向作為影響艾灸療效的關鍵因素之一也應予以重視,相關機制仍需開展后續研究加以解決.

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(本文編輯:蒲曉田)

Effects of different moxibustion-performed directions on the vascular contraction and relaxation factor on rats with cold gaused blood stasis syndrome

WANG Kuan,HU Xue-qing,HUANG Yu-sa,et al.Shanghai Institute of Acupuncture-Moxibustion and Meridian,Shanghai 200030,China Corresponding author:LIU Hui-rong,E-mail:lhr_tcm@126.com

Objective To observe the effects of different moxibustion-performed directions on the vascular contraction and relaxation factors in rats with cold gaused blood stasis syndrome.Methods 32 Wistar rats were divided into control group(A),model group(B),moxibustion performed along the meridian group(C)and moxibustion performed against the meridian group(D),8 rats in each group.After successful established the model of rats with cold gaused blood stasis syndrome,the moxibusition along or against the bladder meridian on rats were performed directionally and repeatedly,the treatment was for 14 days.After treatment,the levels of ET-1 and NO of the blood taken from rats'aortaventralis were detected by ELISA.According to the table of the quantificational score of symptom,observe the activities,hair,excrement,urinate and choroid blood stasis of rats,and calculate the degree of rats with cold gaused blood stasis syndrome.Results Compared with the A group,the quantificational score of symptom and the levelof ET-1 in the B group were all increased with statistically significant difference(P<0.05)and the NO level was decreased significantly(P<0.05).Compared with the B group,the quantificational score of symptom and the level of ET-1 in the C and D group were reduced significantly(P<0.05),and the NO level increased apparently(P<0.05).The quantificational scores of symptom and NO levels in C and D group has statistical difference(P<0.05).Conclusions Both moxibustion groups can promote the NO release, inhibite the ET-1 release and improve the symptom in rats with cold gaused blood stasis syndrome. Moreover,the therapeutic effect of C group is better than D group.

Moxibustion; Direction; Cold gaused blood stasis syndrome; Endothelin-1; Nitric oxide

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.001

國家重點基礎研究發展(973計劃)(2015CB554500);上海中醫藥大學研究生"創新能力培養"專項

200030 上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所[王寬(碩士研究生)、劉慧榮],藥物安全評價中心(呼雪慶、黃玉薩、王清然);上海中醫藥大學岳陽臨床醫學院[劉民(碩士研究生)];上海中醫藥大學聯合培養研究基地蘇州市中醫院(高春鵬)

王寬(1989-),2013級在讀碩士研究生.研究方向:針灸治療腸道疾病臨床與基礎研究.E-mail: wangkuan271@163.com

劉慧榮(1976-),女,博士,研究員,博士生導師.研究方向:針灸治療腸道疾病臨床與基礎研究. E-mail:lhr_tcm@126.com