急性缺糖缺氧通過增強膽堿酯酶表達促進腎小管細胞的炎性損傷

吳明，吳樂鋒，李明利，陸俊福，賴凱，徐跡，劉芬，馮永文

（1、深圳市第二人民醫院重癥醫學科，廣東　深圳　5108035；2、深圳市第二人民醫院介入治療科，廣東　深圳　5108035；3、深圳市第二人民醫院中心實驗室，廣東　深圳5108035；4、南昌大學第一附屬醫院重癥醫學科，江西　南昌330006）

·論著·

急性缺糖缺氧通過增強膽堿酯酶表達促進腎小管細胞的炎性損傷

吳明1，吳樂鋒1，李明利2，陸俊福1，賴凱1，徐跡3，劉芬4，馮永文1

（1、深圳市第二人民醫院重癥醫學科，廣東深圳5108035；2、深圳市第二人民醫院介入治療科，廣東深圳5108035；3、深圳市第二人民醫院中心實驗室，廣東深圳5108035；4、南昌大學第一附屬醫院重癥醫學科，江西南昌330006）

目的探討急性缺糖缺氧導致腎小管細胞損傷的機制。方法分離培養大鼠腎內巨噬細胞、腎小管上皮細胞，構建兩者共培養（transwell）模型，細胞分成對照組及缺糖缺氧（Oxygen and glucose deprivation，OGD）組，給予缺糖缺氧處理細胞1h后再正常培養24h，ELISA法檢測兩組上清液TNF-α，IL-1β和IL-10的濃度，噻唑藍（MTT）檢測腎小管細胞活力及RT-qPCR及Western Blot檢測AChE的mRNA和蛋白的表達。結果在共培養上清液中，對照組與OGD相比，TNF-α（pg/ml）：（231.67±36.28）VS（428.67±43.16）（P＜0.05），IL-1β（pg/ml）：（116.67±21.64）VS（219.63±43.86）（P＜0.05），IL-10（pg/ml）：（235.67± 39.35）VS（432.67±49.72）（P＜0.01）。腎小管細胞活力明顯降低，分別為（88.41±18.25）VS（46.98±13.87）（P＜0.01），OGD組巨噬細胞AChE mRNA和蛋白水平均高于對照組，分別上調了（3.82±0.73）和（2.17±0.46）倍（P＜0.01）。結論急性缺糖缺氧增強了腎臟巨噬細胞膽堿酯酶的表達，通過炎癥介質，介導了急性缺糖缺氧性腎小管細胞損傷。

缺糖缺氧；膽堿酯酶；炎癥介質；腎小管細胞活力

在急性缺氧等各種應激下，毛細血管內皮細胞損傷，白細胞聚集、黏附、激活血小板，釋放大量的炎癥介質，直接介導了腎臟間質內的巨噬細胞的微環境發生改變，使足細胞逐漸向纖維細胞分化，促進了腎臟纖維化的發生［1］。研究顯示急性腎損傷（AKI）的發生除全身血流動力學改變因素外，還與腎臟微環境和炎癥、免疫密切相關［2］。AKI是慢性腎臟疾病（CKD）、終末期腎病（ESRD）、死亡和其他非腎臟疾病的獨立危險因素［3］。因此，全面理解腎臟微環境、免疫、炎癥的關系，對急性腎臟疾病的治療至關重要［4］。

神經-免疫的正負反饋精準調節，對穩定人類健康至關重要。研究顯示膽堿能抗炎通路是由迷走神經介導的實時調控炎癥反應通路［5］。當機體發生炎癥反應時，局部炎癥因子刺激迷走傳入神經纖維，將炎癥信號傳入下丘腦，再經迷走傳出神經纖維向炎癥部位釋放乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），激活單核-巨噬細胞上的煙堿型乙酰膽堿受體7（nicotinic acetylcholine receptor alpha7，nACh-Rα7），從而抑制單核-巨噬細胞的活化，減少TNF-α等促炎因子的釋放，達到調控炎癥反應的目的［6］。神經元細胞分泌的乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterse，AChE）對乙酰膽堿的分解起重要作用。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterse，AChE）不僅存在于神經元細胞中，也存在于免疫細胞上，其中巨噬細胞表達最豐富［7］。因此，研究急性缺糖缺氧性腎臟疾病的神經-免疫調節機制，對急性缺糖缺氧性腎損傷的治療提供新方向。為此，我們先通過分離培養腎臟內的巨噬細胞與腎小管上皮細胞，構建兩者共培養（transwell）模型，探討缺糖缺氧對腎小管細胞活力的影響，并觀察缺糖缺氧對腎臟巨噬細胞膽堿酯酶的影響。

1　材料與方法

1.1腎臟內巨噬細胞分離與培養脫頸處死SD大鼠（8W，SFP級，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），75%酒精侵泡5min，將大鼠倒立提起，外科方法無菌摘取雙側腎臟，置于盛有預冷RPMI-1640培養液（含1%小牛血清）（Gibco美國）的平皿中，剪去結締組織和脂肪。擠壓腎組織通過200目的鋼絲網，獲得單個細胞。離心200×g10min，去上清液。用含1%小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞配成約1×108/ml。獲取單個細胞接種于10%FBS 的DMEM培養液（Gibco美國）于細胞培養瓶中，放置37℃、體積分數5%的CO2培養箱（thermo美國）飽和濕度下培養。用貼壁法純化巨噬細胞并顯微鏡拍照（Olympus，日本）。將腎內巨噬細胞系按3.0× 104cells/ml的密度接種于24孔板上，每孔1～2ml，培養24h后，將培養液換為無血清培養基，培養24h棄原培養液，并經形態學鑒定，鏡下可觀察到貼壁腎巨噬細胞的細胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規則形，有偽足和突起。將此細胞鑒定為巨噬細胞后作為實驗細胞。

1.2腎小管細胞分離與培養動物處理同巨噬細胞分離。分離腎皮質和髓質，取腎皮質剪碎至1mm3大小，使用PBS（Gibco美國）沖洗后離心300×g 10min，反復3次，棄上清液加入配制1g/L I型膠原酶的DMEM消化液，37℃振蕩消化30min，并用移液管輕輕吹到30次，將尚未消化的腎皮質更換到新的膠原酶溶液中，繼續震蕩消化30min，再次吹打30次，將消化后的細胞懸液經100目不銹鋼篩網過濾，并用玻璃棒輕輕研磨同時以DMEM沖洗，網下液體再經200目不銹鋼篩網過濾后將其轉移到離心管中，離心300×g 5min，棄上清液取沉淀，反復2次。使用5ml DEME培養液重懸浮沉淀，并輕輕鋪于預先配置好的45%的percoll（GE Healthcare美國）細胞分離液上，使用高速冷凍離心機離心（4000×g，4℃，30min），離心后可見液體分層，吸取近管底第2層細胞懸液即為腎小管上皮細胞。將分離純化的腎小管上皮細胞用DMEM培養液洗滌并以300×g離心10min，洗滌2次以去殘留的Percoll細胞分離液。最后用含10%小牛血清的DMEM培養液懸浮細胞接種于T25細胞培養瓶中并做好標記，臺盼藍（Sigma美國）染色計數細胞并觀察細胞活力，將細胞配成所需的濃度，經倒置顯微鏡（Olympus日本）觀察到貼壁細胞體積較大，呈多邊鵝卵石樣，細胞之間排列緊密，鑒定為腎小管細胞后進行原代培養及傳代培養。

1.3缺糖缺氧（OGD）及共培養模型的構建將第3代腎小管上皮細胞以5×103/cm2的密度接種于96孔培養板中，當細胞長滿約50%～60%時，10%FBS 的DMEM培養液300μl，放入腎臟巨噬細胞雙細胞培養系統中（transwell板）并培養24h。棄原培養液后，正常組細胞：加入Earle's液（Gibco美國）；缺糖缺氧組（10%XB+OGD）：用無糖Earle's液清洗細胞1次后，分別加入4mmol/ml濃度的Na2S2O4無糖Earle's液，無糖低氧損傷時間為1h。1h后細胞分別用Earle's液清洗1次，加入完全培養液（10% FBS的1640 Gibco美國）培養至24h。

1.4酶聯免疫吸附檢測按照ELISA試劑盒說明，檢測培養細胞的上清液中TNF-α（mybiosource，MBS355371），IL-1β（mybiosource，MBS175941），IL-10（Mybiosource，MBS8506064）的濃度，通過酶標儀（MK3 LAB芬蘭）檢測450nm的吸光度，所有吸光度結果通過標準曲線標準化，計算出樣品水平。

1.5腎小管細胞活力檢測（MTT檢測）取96孔板共培養實驗中的腎小管上皮（約1×104）細胞，置37℃、5%CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中培養24h。加入適當濃度的受試化合物并適當條件下培養24h。每孔加50μl1×MTT（KeyGEN KGA312），在37℃孵育4h。吸出上清液，每孔加150μl DMSO，酶標儀在570nm波長處檢測每孔的光密度（OD值）。細胞的存活率：將各測試孔的OD值減去本底OD值（完全培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD值（完全培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD值取均數±標準差（±s）。細胞的存活率以T/C%表示，T為加藥細胞的OD值，C為對照細胞的OD值。細胞存活率%=（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100%。

1.6RT-qPCR檢測AChE的mRNA相對表達用TRIzol液（Invitrogen，美國）提取腎內巨噬細胞總RNA，RNA的濃度和純度用紫外分光光度計檢測其在260和280nm的吸光度。逆轉錄反應用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa Biotechnology-Co，Ltd，上海，中國）完成，每反應10μl總體系。RT-qPCR用SYBR Premix Ex TaqⅡ kit（TaKaRa BiotechnologyCo，Ltd，上海，中國）完成，每反應20μl體系。PCR擴增用一步法定量PCR系統完成（Applied Biosystems，Foster City，CA，美國），AChE mRNA的表達水平參照標準化的β-actin內參，數據采用2-ΔΔCt表示［8］，并評估樣本間差異。上述各試劑盒操作根據供應商操作說明。AChE和β-actin引物見表1。

表1　AChE和β-actin引物

1.7Western Blot分析為了檢測AChE和對照GAPDH蛋白，用RIPA提取腎巨噬細胞總蛋白，取相同量的蛋白上樣，電泳后，將一抗用TBST（SIGMA）稀釋至1：500（在1.5ml離心管中）；從封閉液中取出膜，室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min；用辣根過氧化物酶（HRP Abcam美國）標記的二抗稀釋液（1：500）室溫下孵育1h，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min，用ECL發光試劑盒檢測。結果定量分析用Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件進行分析，測其IOD（integrated optical density）累積光密度。

1.8統計學處理采用SPSS 18.0軟件進行數據分析。數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1缺糖缺氧對腎內巨噬細胞培養上清液炎癥介質及腎小管細胞活力的影響為了明確急性缺糖缺氧誘導的腎內炎癥介質的表達，我們構建了缺糖缺氧腎內巨噬細胞模型，使用ELISA法檢測細胞培養懸浮液中TNF-α，IL-1β和IL-10濃度。結果顯示OGD組的TNF-α，IL-1β及IL-10表達均高于對照組（見圖1A、B、C）。通過MTT法檢測各實驗組腎小管細胞的活力，結果發現與對照組（Normal cell）相比，10%XB+OGD組腎小管細胞活力明顯降低（P＜0.01）（見圖1D）。

圖1　急性缺糖缺氧對大鼠腎臟巨噬細胞炎癥因子濃度及腎小管的活力的影響

2.3缺糖缺氧對腎巨噬細胞AChE mRNA及蛋白水平表達的影響為明確缺糖缺氧對膽堿能通路的影響，我們檢測了兩組乙酰膽堿酯酶mRNA及蛋白的表達。結果表明：腎巨噬細胞經過缺糖缺氧處理后，與對照組相比，AChE mRNA上調了（3.82± 0.73）倍，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖2A），并且細胞內AChE蛋白水平也升高了（2.17±0.46）倍（圖2B），AChE蛋白表達結果定量分析如 圖2C所示。

圖2　急性缺糖缺氧對大鼠腎臟巨噬細胞AChE mRNA及蛋白的影響

3　討論

2013年針對全國44家醫療機構的急性腎損傷流行病學調查顯示有約25.3%患者的血清肌酐是正常值的2倍或以上，其中約7.0%患者懷疑有急性腎損傷，明顯高于西方發達國家1.9%水平［9，10］。急性缺氧是急性腎損傷的重要原因。缺氧誘導的炎癥細胞浸潤在缺氧性腎損傷中起重要作用，其中巨噬細胞的腎臟浸潤，顯得尤為重要［11］。新近的研究發現，巨噬細胞在不同的微環境中有不同的表型，M1促進炎癥反應，加重組織損傷，M2減輕炎癥反應，促進組織修復等，巨噬細胞的極化狀態對組織的損傷與修復起重要作用［12］。腎臟發生缺血性損傷時，循環中的炎癥介質進入組織，改變了腎臟間質巨噬細胞的微環境。其中TNF-α、IL-1β可以促使巨噬細胞表現為M1型，促進炎癥反應，IL-4、M-CSF、TGF-β可以促使巨噬細胞表達M2型，抑制炎癥反應，促進組織修復［13］。也有研究顯示iPSC-MSC來源的外泌體可抑制內毒素誘導的肺泡巨噬細胞分泌炎性因子，減輕肺損傷［14］。因此，探討腎臟內的巨噬細胞的微環境對急性腎損傷的治療至關重要。

迷走神經的膽堿能通路是一種及時的神經調節通路，激活此通路能有效減少炎性因子的合成和釋放，對缺血再灌注損傷的全身和局部的炎癥反應具有明顯地抑制作用［15］。膽堿能神經末梢分泌乙酰膽堿，激活單核-巨噬細胞上的煙堿型乙酰膽堿受體7，抑制單核-巨噬細胞的活化，減少TNF-α等促炎因子的釋放［16］。神經元細胞分泌的乙酰膽堿酯酶 （acetylcholinesterse，AChE）精準調控乙酰膽堿。避免神經末梢乙酰膽堿的集聚，對維持乙酰膽堿的動態穩定起積極作用。研究顯示AChE不僅存在于神經元細胞中，也存在于免疫細胞上，其中巨噬細胞表達最豐富［7］。當機體受到不良刺激，組織的巨噬細胞能否調節AChE的分泌，適度調節局部的炎癥反應尚不清楚。

為了明確腎臟微環境、炎癥與膽堿能的關系，了解巨噬細胞在腎臟疾病的發展中的重要作用，我們構建OGD模型及腎臟巨噬細胞-上皮細胞共培養體系，以模擬急性缺血缺氧性所致腎小管損傷的病理過程。我們在腎臟巨噬細胞與小管上皮細胞共培養體系中，低糖低氧處理1h再正常培養至24h。結果發現：與對照組相比，OGD組細胞養上清液中TNF-α、IL-1β濃度水平明顯增高，兩者之間的差異有統計學意義（P＜0.05），OGD組腎臟巨噬細胞中AChE mRNA和蛋白水平比正常對照組上調了（3.82±0.73）和（2.17±0.46）倍，并且腎小管細胞活力明顯降低。說明缺糖缺氧促進巨噬細胞表面的膽堿酯酶的表達，通過調節炎癥介質介導了缺糖缺氧性腎小管細胞損傷。

綜上所述，本研究證實了缺糖缺氧增強了巨噬細胞分泌乙酰膽堿酯酶，間接減弱了膽堿能的抗炎作用，改變了腎臟間質細胞周圍的微環境。我們推測，這種微環境的改變，使巨噬細胞表現為M1型，加劇了急性缺氧性炎癥損傷。因此，我們將進一步探討膽堿酯酶與巨噬細胞的表型之間的關系，為調控巨噬細胞的表型，減輕急性缺糖缺氧性腎損傷提供新的線索。

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Acute oxygen and glucose deprivation promotes inflammatory injury of renal tubular cells by enhancing the expression of cholinesterase

WU Ming1，WU LeFeng1，LI Mingli2，LU Junfu1，LAI Kai1，XU Ji3，LIU Fen4，FENG Yongwen1.1.Department of Crit-ical Care Medicine of Shengzhen Second Hospital，Shenzhen 518035，China；2.Department of interventional therapy of Shengzhen Second Hospital，Shenzhen 518035，China；3.Department of Central laboratory of Shengzhen Second Hospital，Shenzhen 518035，China；4.the First Hospital Affiliated to Nan chang University，Nanchang 330006，China.

Objective To investigate the injury mechanism of renal tubular cells induced by acute oxygen and glucose deprivation.Methods Isolation and culture of rat kidney macrophages and renal epithelial cells，constructing co-cultivating model of lacking Oxygen and sugar（Oxygen and glucose deprivation，OGD），Cells were devided into control group and OGD group，and were given OGD treatment for 1 hour，and then carried out normal culture for up to 24 hours in each group.the expression of TNF alpha，IL-1 beta，IL-10 in supernatant fluid was detected by ELISA，the viability of renal tubular cells was determined by MTT，the expression of mRNA and protein of acetylcholine esterase（AChE）were determined by RT-qPCR and Western Blot respectively. Results The levels of TNF alpha（pg/ml）in the supernatant fluid in cultivation system were（231.67±36.28）in control group VS （428.67±43.16）（P＜0.05）in OGD group，the levels of IL-1β（pg/ml）were（116.67±21.64）in control group VS（219.63±43.86）in OGD group（P＜0.05），the levels of IL-10（pg/ml）were（235.67±39.35）in control group VS（432.67±49.72）in OGD group（P＜0. 01）.The viability of renal tubular cells was（88.41±18.25）VS（46.98±13.87）（P＜0.01）；The levels of mRNA and protein of AChE in OGD group were higher than those in control group，they were raised（3.82±0.73）and（2.17±0.46）times respectively（P＜0.01）. Conclusion Acute oxygen and glucose deprivation enhances the expression of cholinesterase in renal macrophages，the acute injury of renal tubular cells induced by OGD was mediated through inflammatory mediators.

Oxygen and glucose deprivation；Cholinesterase；Inflammatory mediators；Renal tubular cell viability

R692.6，R-332

A

1674-1129（2016）04-0412-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.002

國家自然科學基金（81101410）；廣東省醫學科學技術研究基金（A2016353）；廣東省深圳市科技創新委項目（JCYJ20130401112313541；JCYJ20150330102401099）深圳市第二人民醫院基礎-臨床橋梁項目（2015）

吳明，男，1976年11月出生，醫學碩士，副主任醫師，主要從事于急性腎損傷的基礎與臨床研究。

馮永文，男，1959年12月出生，醫學碩士，主任醫師，碩士研究生導師，主要從事于危重患者的救治。E-mail：boshiyy@126.com

（2016-05-05；

2016-07-05）