NLRP3在牙齦卟啉單胞菌感染牙周膜細胞中的表達

潘春玲,韓伶娜,宋　佳,王宏巖,潘亞萍,鐘　鳴

(1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院牙周科,遼寧省口腔醫(yī)學研究所牙周病研究室,沈陽110002;2.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院中心實驗室,沈陽110002)

NLRP3在牙齦卟啉單胞菌感染牙周膜細胞中的表達

潘春玲1,韓伶娜1,宋佳1,王宏巖1,潘亞萍1,鐘鳴2

(1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院牙周科,遼寧省口腔醫(yī)學研究所牙周病研究室,沈陽110002;2.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院中心實驗室,沈陽110002)

目的通過體外建立牙齦卟啉單胞菌(P.gingiva1is)感染牙周膜細胞模型,探討P.gingiva1is ATCC 33277菌株感染牙周膜細胞對NLRP3表達的影響.方法以P.gingiva1is ATCC 33277菌株感染牙周膜細胞,采用ELISA方法檢測細胞白細胞介素(IL)-1β和IL-18蛋白的表達,檢測caspase-1的活性,采用Western b1ot檢測NLRP3的表達.結果感染復數為100∶1, P.gingiva1is ATCC 33277菌株感染牙周膜細胞24、48 h時,NLRP3表達升高,活化caspase-1,誘導IL-1β和IL-18炎性因子合成和分泌,與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.01).結論P.gingiva1is感染牙周膜細胞中NLRP3表達顯著升高,在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用.

牙周炎;牙齦卟啉單胞菌;炎癥復合體

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牙周炎是牙周支持組織的慢性炎性疾病,其主要以局部免疫反應為主,不可逆地侵襲和破壞牙周支持組織,喪失牙周再生和修復能力,最終導致牙齒的松動和脫落.菌斑細菌及其代謝產物是牙周病的始動因子,其中牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingiva1is,P.gingiva1is)是證據較為充分且毒力最強的牙周致病菌之一,研究表明,P.gingiva1is的定植與牙周組織病變的嚴重程度和復發(fā)密切相關[1].牙周膜細胞是牙周膜中最常見的細胞,不僅能夠合成和分泌牙周膜基質中的膠原纖維和蛋白多糖,不斷形成新的主纖維、牙骨質并改建牙槽骨,而且具有吸收膠原、吞噬異物的能力,在牙周組織的保護和修復中起著重要的作用[2].炎癥復合體也稱炎癥小體,是由胞質內模式識別受體參與組裝的多蛋白復合物,其中研究最為廣泛的是NLRP3炎癥小體,其在機體免疫反應和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮作用,是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分.多種病原體和內源性刺激能夠促進NLRP3炎癥復合體蛋白物聚集,招募和激活促炎癥蛋白酶caspase-1,活化的caspase-1切割白細胞介素(inter1eukin,IL)-1β和IL-18前體,導致炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌[3].關于NLRP3炎癥小體在P.gingiva1is感染牙周膜細胞中的作用鮮有報道.本研究以人原代培養(yǎng)的牙周膜細胞與P.gingiva1is共培養(yǎng)為模型,采用Western b1ot、ELISA等方法,探討P.gingiva1is感染牙周膜細胞通過激活NLRP3炎癥復合體,誘導IL-1β和IL-18的產生和分泌,分析其在牙周炎發(fā)生、發(fā)展的作用.

1　材料與方法

1.1牙周膜細胞的培養(yǎng)

牙周組織樣本來自于中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔外科門診.選取20例健康個體作為研究對象,平均年齡16歲,臨床排除急性感染、全身系統(tǒng)性疾病史、家族遺傳病史、吸煙史、特殊服藥史以及牙體及根尖病變.本研究所用牙齒因正畸減數治療需要拔除的正畸牙60顆,均經過研究對象本人同意,并簽署了知情同意書.拔除后的牙齒立即置于含青霉素(200 U/m L)、鏈霉素(200 μg/m L)的低糖DMEM培養(yǎng)液中.在超凈工作臺內,無菌條件下刮取牙根中1/3的牙周膜組織,均勻鋪于6孔培養(yǎng)板底,采用組織塊培養(yǎng)方法,用含15%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的低糖DMEM培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)14 d,組織塊邊緣可見長梭樣成纖維樣細胞爬出,待細胞融合后0.25%胰酶消化,常規(guī)傳代.采用第5～7代細胞牙周膜細胞用于本研究.

1.2細菌的培養(yǎng)

P.gingiva1is ATCC3 3277(中國醫(yī)科大學口腔學醫(yī)院中心實驗室)菌株接種于新鮮配制的含5%無菌脫纖維羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K1的腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基,37℃厭氧(80%N2,10%H2,10% CO2)培養(yǎng)5～7 d傳代.挑單克隆菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,6 000 g、4℃離心10 min收集細菌,PBS洗滌1次,重懸于無抗生素細胞培養(yǎng)基中,在波長600 nm的紫外分光光度計下測定細菌濃度備用.

1.3實驗分組

取生長良好牙周膜細胞,用0.25%的胰蛋白酶消化,用含15%胎牛血清、無抗生素的低糖DMEM培養(yǎng)液制備細胞懸液,調整細胞數為1.5X106/mL,接種1 mL細胞懸液于25 mL培養(yǎng)瓶中,5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)24 h,待細胞90%以上貼壁后PBS洗滌2次,感染組加入配置好的含1X109/mL P.gingiva1is的DMEM培養(yǎng)基150 μL,陰性對照組加入新鮮培養(yǎng)基150 μL,每組均復種3孔.此時,感染復數(mu1tip1icity of infection,MOI)為100∶1.細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h.

1.4ELISA檢測IL-1β和IL-18蛋白的表達

吸取細胞培養(yǎng)的上清液,按ELISA試劑盒說明操作,用酶標儀測定各組450 nm下的吸光度值.根據IL-1β和IL-18的標準品吸光度值和已知濃度繪制標準曲線,在標準曲線上找到各樣品組吸光度值對應的IL-1β和IL-18的濃度.

1.5caspase-1活性檢測

用胰酶消化貼壁細胞,并收集至細胞培養(yǎng)液中.600 g、4℃離心5 min收集細胞,小心吸除上清, PBS洗滌1次,加入裂解液(用Bradford法檢測蛋白濃度),重懸沉淀,冰浴裂解15 min.4℃、16 000～ 20 000 g離心10～15 min,把上清轉移到冰浴預冷的96孔板中,用酶標儀測定各組A405的吸光度值,樣品的A405減去空白對照的A405,即為樣品中caspase-1催化產生的對硝基苯胺產生的吸光度,即折算出caspase-1的酶活力單位.

1.6Western b1ot檢測NLRP3蛋白的表達

用細胞刮取牙周膜細胞,加入蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液制備蛋白提取液,BCA法測定蛋白質濃度,SDS-PAGE凝膠電泳,PVDF膜轉膜封閉后,與NLRP3蛋白抗體孵育雜交,最后采用ECL試劑盒化學發(fā)光法顯示結果并分析.β-actin蛋白作為參考對照蛋白.

1.7統(tǒng)計學處理

應用統(tǒng)計學軟件SPSS 11.0進行統(tǒng)計學分析,2組比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2　結果

2.1P.gingiva1is ATCC 33277感染牙周膜細胞中IL-1β和IL-18蛋白的表達

MOI為100∶1時,P.gingiva1is ATCC 33277感染牙周膜細胞24 h時IL-1β蛋白表達明顯升高,約是對照組的2.5倍,隨著時間的延長,當感染達到48 h時IL-1β蛋白表達為對照組的3倍.IL-18蛋白的表達在24和48 h時明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01).IL-1β和IL-18蛋白表達在24和48 h時比較,隨著時間延長,IL-1β和IL-18蛋白表達增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01).見表1.

2.2P.gingiva1is ATCC 33277感染牙周膜細胞中caspase-1的活性

MOI為100∶1時,P.gingiva1is ATCC 33277感染牙周膜細胞24和48 h時,caspase-1活性與對照組相比明顯升高,約是對照組的2倍和2.5倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01).隨著時間延長,caspase-1活性增強,24和48 h比較差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01).見表1.

表1　P.gingivalis ATCC 33277感染牙周膜細胞中IL?1β、IL?18蛋白的表達和caspase?1活性Tab.1 The expressions of IL?1β and IL?18 and the activity of caspase?1 in the human periodontal ligam ent cells infected w ith P.gingivalis ATCC 33277

2.3P.gingiva1is ATCC 33277感染牙周膜細胞中NLRP3蛋白的表達

MOI為100∶1時,P.gingiva1is ATCC 33277感染牙周膜細胞24和48 h時,NLRP3蛋白的表達與對照組相比明顯升高,同時48 h時NLRP3蛋白的表達明顯高于24 h(P<0.01).見圖1.

圖1　P.gingivalis ATCC 33277感染牙周膜細胞中NLRP3蛋白的表達Fig.1 The protein exp ression of NLRP3 in the human periodontal ligam ent cells infected w ith P.gingivalis ATCC 33277

3　討論

先天免疫系統(tǒng)是宿主抵御外界病原微生物侵入的第一道天然屏障,在抗感染過程起著重要的作用.絕大多數的免疫細胞能夠表達一系列的模式識別受體,識別和監(jiān)控細胞內和細胞外微環(huán)境的病原體相關分子模式.當宿主受到病原微生物感染或其他危險刺激作用后,模式識別受體識別病原體相關分子模式,細胞信號通路被激活,誘發(fā)一系列細胞因子以及免疫物質的分泌,排除異己成分,保護宿主.近年來研究表明,NOD樣受體(nuc1eotide binding o1igomerization domain-1ike receptors,NLRs)是存在于細胞質中識別病原體相關分子模式及危險相關分子模式的模式識別受體.當大量的微生物感染和內源性信號刺激后,NLRs可與其特定蛋白形成多蛋白復合體,控制炎性因子的成熟和分泌,從而引發(fā)一系列的效應反應,這類蛋白復合體稱為炎癥小體.NLRP3是NLRs家族的重要成員之一,也是目前研究最深入的炎癥復合體.它主要由NLRP3的框架蛋白、CARD結構域的凋亡相關顆粒樣接頭蛋白和caspase-1組成.

P.gingiva1is是一種革蘭陰性專性厭氧桿菌,具有多種毒力因子,包括菌毛、外膜蛋白、膜泡和牙齦素等,可以成功的定植在口腔多種組織內,是與牙周炎密切相關的紅色復合體的重要成員之一.研究已證實,P.gingiva1is對慢性牙周炎具有明確的致病作用[4].牙周膜是位于牙骨質和牙槽骨之間的致密結締組織,是牙周支持組織的重要組成部分之一,由細胞、基質和纖維構成,能夠緩沖咀嚼過程中的咬合力、在維持牙齒穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用.牙周膜在胚胎發(fā)育過程中被認為來源于原始牙囊組織中未分化的間充質細胞,離體培養(yǎng)的牙周膜細胞是一個含有多種類型細胞的群體,包括大量未分化的功能細胞,能增殖產生成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質細胞,具有很強的分化增殖能力,與牙周組織再生修復密切相關.研究表明NLRP3能夠被多種環(huán)境因子、細菌和病毒激活,NLRP3在外周血淋巴細胞、單核細胞、上皮細胞以及牙齦上皮細胞均表達,參與機體固有免疫防御反應[5].有研究[6]采用P.gingiva1is不同菌株感染大鼠模型發(fā)現(xiàn),大鼠巨噬細胞、牙齦、動脈上皮中均可見NLRP3升高,并且細菌的菌毛和牙齦素等毒力因子的刺激作用更強.但是Guo等[7]采用活體P.gingiva1is感染口腔上皮細胞系并沒有NLRP3表達,P.gingiva1is提取的內毒素能夠明顯誘導上皮細胞NLRP3的表達.本研究結果顯示,P.gingiva1is感染牙周膜細胞,NLRP3表達明顯升高,表明在牙周炎的發(fā)生過程中NLRP3炎癥復合體能夠被P.gingiva1is激活,在初始抵御外界病原體的感染和侵入過程中發(fā)揮作用.

當外界刺激誘導NLRP3活化后,其將結合凋亡相關顆粒樣接頭蛋白,進而募集pro-caspase-1進行自我剪切和活化,生成具有活性的caspase-1,激活炎癥體信號通路,介導炎性反應,抵抗感染,保護宿主.caspases是一種存在于細胞質中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,在正常的細胞內caspase以非活性狀態(tài)存在,被活化后能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進行切割,轉變成有活性的caspase,進而激活細胞的一系列反應,誘導炎性反應和細胞凋亡.caspase-1是第一個在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的caspase,主要參與細胞因子介導的炎性反應.在生理情況下caspase-1以不具有活性的酶原形式存在,當在病原體和外界環(huán)境刺激下,自動催化加工,蛋白發(fā)生剪切,成為包含p20和p10 2種亞基的活性形式[8].caspase-1的活化過程主要由炎癥體調控,誘導炎癥體信號通路,加工釋放一系列促炎性因子,包括IL-1β和IL-18.

白介素是一種白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子,在組織細胞間信息傳遞,激活與調節(jié)免疫細胞,介導T、B細胞活化、增殖與分化,并在炎性反應中起重要作用[9].其中IL-1β的釋放能夠募集中性粒細胞,誘導多種細胞因子和炎癥趨化因子、黏附分子的釋放;引起機體發(fā)熱腫脹;激發(fā)機體繼發(fā)性獲得性免疫應答等.IL-18是先天性和獲得性免疫應答的一個重要調節(jié)因子,可誘導T細胞和自然殺傷細胞產生干擾素,參與機體抗感染免疫;促進Th1細胞的生長和分化;作為促炎性因子,參與機體的炎性反應.研究表明,IL-1β和IL-18的合成和分泌受到炎癥復合體的調控.本研究證實,在P.gingiva1is感染牙周膜細胞后caspase-1活性升高,誘導IL-1β和IL-18的合成和釋放,一方面對抗機體對外界刺激的保護性反應,同時炎性因子的分泌也會對機體造成損傷.

NLRP3在P.gingiva1is感染牙周膜細胞誘導炎性反應的具體作用機制仍不清楚,NLRP3如何識別P.gingiva1is、如何觸發(fā)炎性反應、通過何種激活途徑等尚待深入研究.研究炎癥復合體在P.gingiva1is感染牙周膜細胞的表達,探討感染微環(huán)境對牙周膜細胞的影響,將為應用牙周膜細胞修復炎性微環(huán)境中破壞的牙周組織應用,提供理論指導和治療靶點.

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(編輯陳姜)

Expression of NLRP3 in Human Periodontal Ligament Cells with Porphyromonas gingivalis Infection

PAN Chun-1ing1,HAN Ling-na1,SONGJia1,WANGHong-yan1,PANYa-ping1,ZHONGMing2
(1.Department of Periodontics,Schoo1 of Stomato1ogy,China Medica1 University,Laboratory of Periodontics,Liaoning Institute of Denta1 Research，Shenyang 110002, China；2.DepartmentofCentra1Laboratory，Schoo1ofStomato1ogy，ChinaMedica1University，Shenyang110002，China）

Objective Toinvestigate theexpressionofNLRP3 inhuman periodonta11igamentce11(hPDLC)infectedwith Porphyromonasgingiva-1is(P.gingiva1is)through an invitromode1.M ethods Theactivityofcaspase-1and theprotein1eve1sof inter1eukin(IL)-1βand IL-18weremeasured by ELISA after P.gingiva1is ATCC 33277 infection.The protein 1eve1 of NLRP3 was determined by Western b1ot in hPDLCs infected with P. gingiva1is ATCC 33277.Results Themu1tip1icityofinfectionwas100∶1.Theprotein1eve1ofNLRP3 inhPDLCsinfectedwith P.gingiva1is was significant1yhigher than the contro1group atboth 24h and48 h.At thesame time,weobserved thatexpression1eve1sof IL-1βand IL-18 and theactivity of caspase-1 were significant1y increased at 24 h and 48 h in the infected ce11s.Conclusion The inf1ammasome of NLRP3 was high1y expressed in hPDLCsinfectedwith P.gingiva1is,whichp1aya ro1e in theoccurrenceand deve1opmentofperiodontitis.

periodontitis;Porphyromonas gingiva1is;inf1ammasome

R781.4

A

0258-4646(2016)03-0201-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.003

國家自然科學基金青年科學基金(81500862)

潘春玲(1975-),女,副教授,博士.

潘亞萍,E-mai1:yppan@mai1.cmu.edu.cn

2015-11-23

網絡出版時間: