斑蝥酸鈉誘導RTP801表達促進結腸癌細胞HCT116凋亡

張　霞,關洪全

(1.遼寧省腫瘤醫院內五科,沈陽110042;2.遼寧中醫藥大學免疫與病原生物教研室,沈陽110847)

斑蝥酸鈉誘導RTP801表達促進結腸癌細胞HCT116凋亡

張霞1,2,關洪全2

(1.遼寧省腫瘤醫院內五科,沈陽110042;2.遼寧中醫藥大學免疫與病原生物教研室,沈陽110847)

目的探討斑蝥酸鈉注射液對結腸癌細胞凋亡的影響作用及分子機制.方法通過異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐滲透實驗觀察終濃度為0.1、0.25、0.5、1、2 μg/mL斑蝥酸鈉注射液處理24 h后對HCT116細胞凋亡的影響;分別用rea1-time PCR和Western b1ot方法檢測終濃度為0.1、0.25、0.5、1、2 μg/mL斑蝥酸鈉注射液處理24 h后對促凋亡基因DNA損傷修復基因(RTP801)表達的影響;運用低氧誘導因子1α(HIF-1α)質粒和HIF-1α-siRNA轉染檢測HIF-1α信號通路對RTP801的影響.結果斑蝥酸鈉注射液誘導單層細胞滲透性增加,FITC-右旋糖酐滲透率增高.細胞受斑蝥酸鈉注射液刺激后,RTP801的mRNA和蛋白水平上調,且都呈濃度依賴性.HIF-1α質粒轉染后,RTP801蛋白表達增加;加入HIF-1α-siRNA,斑蝥酸鈉注射液對RTP801的上調作用降低,且FITC-右旋糖酐滲透率下降.結論斑蝥酸鈉通過HIF-1α途徑增加RTP801的表達,誘導結腸癌細胞HCT116凋亡.

斑蝥酸鈉;結腸癌;低氧誘導因子1α;DNA損傷修復基因;凋亡

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結腸癌是全球十分常見的惡性腫瘤之一,發病率和死亡率居癌癥疾病第3位,嚴重影響人類健康[1,2].研究結腸癌的發病機制有助于對其早期預防和治療.結腸癌的發生與結腸細胞的增殖、凋亡相關,主要原因包括細胞周期調控失常與促凋亡基因表達降低[3,4]2方面.RTP801又名DNA損傷修復基因(regu1ated in deve1opment and DNA damage responses,REDD1),是一種促凋亡因子,廣泛存在于人體多種組織,正常情況下處于低表達狀態[5].在低氧條件下,低氧誘導因子1α(hypoxia inducib1e factor-1α,HIF-1α)被激活[6],HIF-1α作為一種轉錄因子能夠與RTP801基因啟動子上相應的結合位點結合,誘導RTP801的表達[7].

斑蝥酸鈉是斑蝥素的半合成藥物,是斑蝥素與氫氧化鈉共熱后的水解生成物,其毒性較斑蝥素低,抗腫瘤效果顯著,已長期用于臨床治療肝癌、食管癌等惡性腫瘤疾病[9].大量研究報道斑蝥酸鈉加速癌細胞凋亡,但促凋亡因子RTP801在這一過程中的作用尚屬未知.因此,本文通過研究斑蝥酸鈉對RTP801基因和蛋白表達的調控作用,探究斑蝥酸鈉治療結腸癌的分子機制.

1　材料與方法

1.1材料

細胞系及主要試劑:人結腸癌上皮細胞系HCT116購自美國ATCC細胞庫.DMEM培養基購自美國HyC1one公司,胰酶購自美國Ce11gro公司,血清購自天津市灝洋生物公司,LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司,HIF-1α-siRNA由上海吉瑪公司合成,FITC-右旋糖酐購自美國Sigma公司,0.4 μm孔徑transwe11和小鼠抗HIF-1α抗體購自美國Mi11ipore公司,Trizo1購自美國Thermo公司,PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司,兔抗RTP801抗體購自美國Proteintech group公司,小鼠抗β-actin抗體和羊抗鼠、羊抗兔二抗購自美國Santa cruze公司,斑蝥酸鈉注射液購自貴州金橋藥業有限公司(批號H52020602).

1.2方法

1.2.1細胞培養:在37℃,5%CO2培養箱中,用含10%胎牛血清和青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/ mL)DMEM培養基培養HCT116細胞,隔天換液.細胞長滿后用胰蛋白酶消化傳代,或者重新接種在6孔板中用于后續實驗.

1.2.2RT-PCR:Trizo1提取細胞RNA,紫外分光光度法確定mRNA濃度.采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA,反應條件為37℃,15 min,85℃,5 s.逆轉錄后用rea1-time PCR方法測定mRNA的表達量,反應條件為95℃預變性5 min,95℃10 s, 60℃10 s,72℃10 s,共40個循環.目的引物為RTP801,內參引物為GADPH.采用2-ΔΔCt法對實驗數據定量分析.GADPH上游引物序列ACCACAGT CCATGCCATCAC,下游引物序列TCCACCACCCTG TTGCTGTA;RTP801上游引物序列CAAGATCCAG GGGCTGTTTA,下游引物序列CACCCCAAAAGTT CAGTCGT.

1.2.3Western b1ot:蛋白裂解液法提取細胞中總蛋白,冰上操作并靜置10 min.50 000 r/min離心10 min,95℃加熱10 min.BCA法測定蛋白濃度.用10%SDS-PAGE法分離電泳,90 V轉膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗分別為小鼠抗HIF-1α抗體,兔抗RTP801抗體和小鼠抗β-actin抗體,4℃孵育過夜(濃度為1∶1 000),二抗常溫孵育1 h(濃度為1∶ 2 500),ECL發光液檢測.Image J軟件測定條帶灰度值并定量分析.

1.2.4HIF-1α過表達質粒[10]和HIF-1α-siRNA轉染:以往研究[7]發現促凋亡基因RTP801啟動子上有轉錄因子HIF-1α結合位點,因此本研究加入HIF-1α過表達質粒或HIF-1α-siRNA探究斑蝥酸鈉是否通過HIF-1α信號通路調節RTP801的表達.將細胞均勻分布在6孔板中,待其長滿至80%.取2個滅菌的1.5 mL EP管標記A、B并配置下列溶液.溶液A,將HIF-1α質粒或HIF-1α-siRNA溶于250 μL無血清無雙抗DMEM培養基中;溶液B,將10 μL LipofectamineTM2000試劑稀釋于250 μL無血清無雙抗DMEM培養基中,溶液A和B都放于室溫靜置5 min.混勻溶液A、B,常溫靜置30 min.對照組加入空載質粒.去掉6孔板中原培養基,將DNA/LipofectamineTM2000混合物加入6孔板,6 h后更換含血清和雙抗培養基,轉染時間為48 h.HIF-1α-siRNA序列為5′-AGAGGUGGAUAUGUGUGGGdTdT-3′,scramb1ed -siRNA序列為5′-AUGUAUUGGCCUGUAUUAG-3′[11].

1.2.5異硫氰酸熒光素(f1uores cein iso-thiocyanat, FITC)-右旋糖酐滲透實驗:Lopez等[12]在血腦屏障研究中使用FITC-右旋糖酐滲透實驗檢測細胞凋亡情況.同時,Nie1sen等[13]在腸上皮細胞凋亡檢測方面也同樣使用了FITC-右旋糖酐滲透方法.因此,本研究選用單層細胞FITC-右旋糖酐滲透性評價細胞凋亡情況.選擇杯底孔徑為0.4 μm的微孔濾膜封閉的24孔板嵌套transwe11小室,在上室底部均勻涂布膠原蛋白.將1X106個細胞接種在transwe11小室中,并加入150 μL含血清雙抗DMEM培養基,在transwe11下室中加入600 μL含血清雙抗DMEM培養基,隔天換液.培養10 d后每個transwe11上室加入200 μL FITC-右旋糖酐(10 mg/mL),4 h后在下室中抽取100 μL DMEM培養基,酶標儀測吸光度[14].

1.3統計學分析

2　結果

2.1斑蝥酸鈉增加結腸癌單層細胞滲透性

本研究用不同濃度的斑蝥酸鈉注射液刺激細胞,與不加藥物的對照組相比,加入藥物的實驗組FITC-右旋糖酐滲透率增加,且與斑蝥酸鈉注射液濃度呈正相關,具有濃度依賴性,見圖1.

圖1　斑蝥酸鈉對FITC?右旋糖酐滲透性的影響Fig.1 The influence o f sodium cantharid inate on FITC?Dextran permeability

2.2斑蝥酸鈉刺激RTP801mRNA的表達

為了研究斑蝥酸鈉對結腸癌細胞促凋亡基因RTP801影響,本研究用rea1-time PCR方法檢測了RTP801mRNA的表達.研究結果表明斑蝥酸鈉注射液刺激后,RTP801mRNA表達明顯上調,且當藥物濃度達到2 μg/mL時,mRNA表達量增加了約16倍,見圖2.

圖2　斑蝥酸鈉對RTP801m RNA水平的影響Fig.2 The e ffect of sodium cantharid ina te on the m RNA leve l o f RTP801

2.3斑蝥酸鈉誘導RTP801蛋白的表達

本研究繼續檢測了RTP801蛋白水平的表達. Western b1ot結果顯示隨著藥物濃度的增加,RTP801蛋白表達量也逐漸增加,灰度值定量分析表明RTP801表達與藥物濃度呈正相關,與mRNA結果一致,見圖3.

2.4斑蝥酸鈉通過HIF-1α信號通路調節RTP801的表達

用HIF-1α質粒和HIF-1α-siRNA轉染實驗證實HIF-1α信號通路對RTP801的調控作用.結果證明HIF-1α過量表達能夠上調RTP801蛋白表達,且具有質粒濃度依賴性.加入HIF-1α-siRNA后,斑蝥酸鈉注射液對RTP801的誘導作用下降,見圖4.同時,FITC-右旋糖酐滲透實驗結果也證實了HIF-1αsiRNA阻止了斑蝥酸鈉注射液誘導的單層細胞滲透性升高,抑制了結腸癌細胞凋亡,見圖5.

圖3　斑蝥酸鈉對RTP801蛋白水平的影響Fig.3 The im pac t of sodium can tha ridinate on RTP801 protein level

圖4　細胞轉染實驗檢測HIF?1α通路的作用Fig.4 The func tion of HIF?1α pathway tested by transfection assay

3　討論

結腸癌是全世界致死人數最高的腫瘤之一,嚴重影響著人類的健康[15,16].近年來,隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改善,我國結腸癌發病率呈明顯上升趨勢.細胞凋亡水平降低是結腸癌發生的主要原因之一.Arai等[17]檢測了27例大腸息肉狀腺瘤和8例絨毛狀腺瘤,研究發現這2種疾病的凋亡指數均明顯下降.Xun等[18]研究發現,鞘氨醇激酶2抑制劑能夠誘導結腸癌細胞凋亡,治療結腸癌疾病.

圖5　HIF?1α?siRNA對FITC?右旋糖酐滲透性的影響Fig.5 The in fluence of HIF?1α?siRNA on FITC?Dextran permeability

斑蝥酸鈉在臨床治療中具有明顯的抗腫瘤效應,研究[19]表明斑蝥酸鈉能誘導人膀胱癌EJ細胞凋亡,治療膀胱癌疾病.但其在治療結腸癌疾病方面的報道卻很少,相關分子機制也不明晰.本研究發現斑蝥酸鈉能促進結腸癌細胞凋亡,抑制結腸癌疾病的發生和發展.研究證實斑蝥酸鈉刺激人結腸癌細胞HCT116后,細胞凋亡發生且單層屏障遭破壞,FITC-右旋糖酐滲透性明顯增高.RTP801作為一種促凋亡基因,在細胞凋亡過程中發揮了重要作用,研究[20]發現RTP801水平升高誘導了小鼠肺細胞凋亡.為了明確其分子機制本研究運用分子生物學技術分別在基因和蛋白水平檢測了斑蝥酸鈉對其表達量的影響.研究結果表明斑蝥酸鈉不僅誘導RTP801 mRNA表達,還升高其蛋白表達量.結合相關文獻對斑蝥酸鈉的研究報道,認為斑蝥酸鈉誘導細胞凋亡過程是其治療癌癥疾病的重要因素之一.

轉錄因子HIF-1α調控促凋亡基因RTP801的表達.為了明確上游控制元件HIF-1α對RTP801的調控作用,本研究開展了HIF-1α質粒轉染實驗和HIF-1α-siRNA干擾實驗.實驗結果發現,HIF-1α質粒過表達上調RTP801蛋白水平,說明HIF-1α信號通路激活后誘導RTP801基因轉錄水平.相反,HIF-1αsiRNA抑制了斑蝥酸鈉誘導的RTP801蛋白表達,同時也降低了斑蝥酸鈉誘導的FITC-右旋糖酐滲透性增加.Sagawa等[21]研究發現HIF-1α mRNA水平升高,激活其下游基因RTP801和BNIP3表達,誘導細胞凋亡發生,同時,HIF-1α-siRNA下調HIF-1α表達后抑制了細胞凋亡.因此,HIF-1α信號通路在細胞凋亡過程中發揮重要作用.但是斑蝥酸鈉與HIF-1α的相互作用機制尚不明晰.研究[6]報道HIF-1α可以在低氧環境和炎癥狀況下被誘導,或許斑蝥酸鈉對HIF-1α的調控作用與腫瘤壞死因子、白細胞介素等炎性因子有關,但這一假設還需要進一步的研究證實.

綜上所述,斑蝥酸鈉通過HIF-1α通路調控RTP801的表達,誘導細胞凋亡發生.這一研究發現為臨床治療結腸癌疾病提供了參考依據,也為推廣斑蝥酸鈉奠定了基礎,但斑蝥酸鈉是否可用于結腸腫瘤的治療還需要大量的實驗性基礎研究來證實.

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(編輯于溪)

Sodium Cantharidinate-induced RTP801Expression PromotesApoptosisofColonic Cancer CellLineHCT116

ZHANGXia1,2,GUANHong-quan2
(1.The Fifth Ward Department of Interna1 Medicine,Liaoning Provincia1 Tumor Hospita1,Shenyang 110042,China;2.Department of Microbio1ogy and Immuno1ogy, LiaoningUniversityofTraditiona1ChineseMedicine,Shenyang110847,China)

Objective To investigate the impactofsodium cantharidinateon apoptosisofco1onic cancerce111ineHCT116 and exp1ore itsmo1ecu1ar mechanism.Methods HCT116 ce11s were treated with sodium cantharidinate with different concentrations of 0.1,0.25,0.5,1,2 μg/mL for 24 h. The apoptosis of HCT116 ce11s was assessed by FITC(F1uorescein iso-thiocyanat)-Dextran permeabi1ity assay.RTP801 expression was determined by rea1-time PCR andWestern b1ot.Theaction ofHypoxia inducib1e factor-1α(HIF-1α)signa1ingpathwaywasmeasured by HIF-1αp1asmidsand HIF-1α-siRNA transfection assays.Results Sodium cantharidinate increased ce11 mono1ayer permeabi1ity and FITC-Dextran infi1tration.Both of mRNA and protein 1eve1s of RTP801 were up-regu1ated after sodium cantharidinate treatment in a dose-dependent manner.After HIF-1α p1asmids transfection,RTP801 expression was increased marked1y,whi1e RTP801 and permeabi1ity up-regu1ations were both b1ocked by HIF-1α-siRNA in the presence of sodium cantharidinate.Conclusion Sodium cantharidinate increases RTP801 expression through HIF-1α pathway,which fina11y induceHCT116 ce11sapoptosis.

sodium cantharidinate;co1on cancer;HIF-1α;RTP801;apoptosis

R735.3

A

0258-4646(2016)03-0222-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.008

張霞(1979-),女,主治醫師,碩士研究生.

關洪全,E-mai1:hongquanguan@sina.com

2015-09-15

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