乙酰化對(duì)二甲基精氨酸二甲胺水解酶1表達(dá)水平的影響

王　曦,李英慧,陳芳杰

(1.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院軍人病區(qū),沈陽110034;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,沈陽110122)

乙酰化對(duì)二甲基精氨酸二甲胺水解酶1表達(dá)水平的影響

王曦1,李英慧2,陳芳杰2

(1.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院軍人病區(qū),沈陽110034;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,沈陽110122)

目的以去乙?；敢种苿┒∷徕c(NaBu)和乙酰轉(zhuǎn)移酶p300作為乙?；饔靡蛩?探討人胚腎HEK293細(xì)胞中乙?；瘜?duì)二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)表達(dá)水平的調(diào)節(jié).方法應(yīng)用rea1-time PCR方法檢測(cè)NaBu刺激或轉(zhuǎn)染野生型及突變型p300表達(dá)載體后DDAH1mRNA表達(dá)水平的變化;應(yīng)用Western b1ot方法檢測(cè)NaBu和p300對(duì)DDAH1蛋白表達(dá)水平的影響.結(jié)果Rea1-time PCR結(jié)果顯示NaBu以時(shí)間依賴方式上調(diào)DDAH1mRNA表達(dá)水平,同時(shí)轉(zhuǎn)染野生型p300表達(dá)載體顯著上調(diào)DDAH1mRNA水平,而突變型p300作用不明顯;Western b1ot結(jié)果顯示NaBu及野生型p300可提高DDAH1蛋白表達(dá),但突變型p300無此作用,與對(duì)DDAH1mRNA表達(dá)的作用一致.結(jié)論乙?；缮险{(diào)HEK293細(xì)胞中DDAH1mRNA和蛋白表達(dá)水平.

二甲基精氨酸二甲胺水解酶1;丁酸鈉;p300;乙酰化

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一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種與血壓水平密切相關(guān)的有生物活性的小分子物質(zhì),它在體內(nèi)由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化合成.NOS包括神經(jīng)型(neurona1 NOS,nNOS)、誘導(dǎo)型(inducib1e NOS,iNOS)和內(nèi)皮型(endothe1ia1 NOS, eNOS)3種.非對(duì)稱性二甲基精氨酸(asymmetrica1 dimethy1arginine,ADMA)是體內(nèi)3種NOS的抑制劑,它能夠抑制NOS活性,降低NO生物效應(yīng).ADMA由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethy1arginine dimethy1aminohydro1ase,DDAH)降解[1～3],后者包括DDAH 1和DDAH 2兩種亞型.DDAH 1是腎臟近曲小管和肝臟中的主要亞型,其表達(dá)水平上調(diào)可提高NO生物效應(yīng),降低血壓.乙酰化是調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的一種重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制.本研究以去乙?；敢种苿┒∷徕c(NaBu)和乙酰轉(zhuǎn)移酶p300作為乙?；饔靡蛩?探討乙?；瘜?duì)人胚腎HEK293細(xì)胞中DDAH1表達(dá)水平的影響,從而尋找DDAH1基因的一種表達(dá)調(diào)控機(jī)制.

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng).1 mmo1/L NaBu刺激細(xì)胞,分別于0、6、12、24、48 h后收獲細(xì)胞.應(yīng)用Lipofectamine 2000(美國In-vitrogene公司)轉(zhuǎn)染野生型或組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acety1transferase,HAT)結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞.

1.2RNA提取及rea1-time PCR

應(yīng)用TRIzo1試劑常規(guī)方法提取收獲細(xì)胞的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)合成cDNA.應(yīng)用SYBR Green染料法進(jìn)行rea1-time PCR擴(kuò)增,引物序列如下:DDAH1特異性引物,上游,5′-GGCAGATGGGTTGCATTTGA-3′,下游,5′-TGTCAT CAGGCACAGTGAGT-3′;同時(shí)β-actin作為內(nèi)參,其引物序列如下:上游,5′-AGCAGATGTGGATCAGCA AG-3′,5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3′.PCR在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行,采用相對(duì)定量方法,每個(gè)樣品擴(kuò)增3次,取平均值作為樣品的相對(duì)表達(dá)量.

1.3蛋白提取及Western b1ot

使用單去污裂解液提取細(xì)胞總蛋白.煮沸后上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,低溫電轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉.分別以1∶500和1∶1 000稀釋的DDAH1或β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)為一抗進(jìn)行雜交2 h,洗膜后加入1∶3 000稀釋的二抗雜交2 h.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào).以DDAH1灰度值與β-actin灰度值的比值作為DDAH1蛋白相對(duì)表達(dá)量.

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1乙?；瘜?duì)DDAH1mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)

2.1.1NaBu刺激對(duì)DDAH1mRNA水平的影響:rea1 -time PCR結(jié)果顯示(圖1),NaBu刺激細(xì)胞不同時(shí)間后,DDAH1mRNA表達(dá)水平以時(shí)間依賴方式上升, 24 h后表達(dá)水平達(dá)峰值,因此后面的實(shí)驗(yàn)中選擇刺激24 h的時(shí)間點(diǎn).

2.1.2p300對(duì)DDAH1 mRNA水平的影響:應(yīng)用野生型p300表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,DDAH1 mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),而HAT結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300表達(dá)載體(p300 mut)作用不明顯(圖2, P>0.05),提示p300對(duì)DDAH1mRNA水平的影響依賴于HAT結(jié)構(gòu)域.

2.2乙酰化對(duì)DDAH1蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)

2.2.1NaBu刺激對(duì)DDAH1蛋白水平的影響:Western b1ot結(jié)果顯示,NaBu刺激后,DDAH1蛋白表達(dá)水平顯著上升,與mRNA表達(dá)水平變化一致,見圖3.

2.2.2p300對(duì)DDAH1蛋白水平的影響:結(jié)果顯示,野生型p300顯著上調(diào)DDAH1表達(dá),而突變型p300無此作用,這與p300對(duì)DDAH1 mRNA水平的作用一致,見圖4.

圖1　NaBu刺激不同時(shí)間后DDAH1m RNA表達(dá)水平的變化Fig.1 Changes of DDAH1 mRNA level afte r NaBu trea tm ent of different time periods

圖2　p300對(duì)DDAH1 m RNA表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect o f p300 on DDAH1 m RNA exp ression

3　討論

多種蛋白質(zhì)(包括組蛋白和許多轉(zhuǎn)錄因子)的乙?；瘏⑴c調(diào)控基因表達(dá)水平,蛋白的乙?；街饕?類酶的調(diào)節(jié),包括HAT和組蛋白去乙酰化酶(histone deacety1ase,HDAC).NaBu是一種HDAC抑制劑,它可以抑制多種HDAC的作用,從而上調(diào)蛋白乙?；?p300是一種最為經(jīng)典的HAT,它可以調(diào)節(jié)組蛋白及多種轉(zhuǎn)錄因子的乙?；?從而參與很多基因的表達(dá)調(diào)控.p300是一種具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白質(zhì),其中HAT結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湟阴；δ苤陵P(guān)重要[4,5].本研究選擇了NaBu刺激細(xì)胞、轉(zhuǎn)染野生型、HAT結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300表達(dá)載體作為乙酰化作用因素來處理細(xì)胞.

在體內(nèi)ADMA的蓄積可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙、阻力增加,其水平在高血壓患者體內(nèi)中明顯升高.研究表明ADMA的蓄積主要由于DDAH作用減弱引起,許多高血壓危險(xiǎn)因素通過降低DDAH活性影響NOS和NO作用,從而參與高血壓的發(fā)生發(fā)展[6～8].有研究[9]發(fā)現(xiàn)DDAH1轉(zhuǎn)基因小鼠血漿ADMA水平顯著下降,NOS和NO生物效應(yīng)明顯提高,并可使小鼠收縮壓下降13 mmHg.因此DDAH1基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)對(duì)血壓水平至關(guān)重要.

圖3　NaBu對(duì)DDAH1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of NaBu on DDAH1 p rotein level

圖4　p300對(duì)DDAH1蛋白水平的影響Fig.4 Effect of p300 on DDAH1 protein expression

為探討乙?；欠駞⑴cDDAH1基因表達(dá)的調(diào)節(jié),本研究一方面選擇了NaBu來抑制HDAC作用,另一方面通過外源轉(zhuǎn)染p300表達(dá)載體增加HAT作用.結(jié)果顯示,NaBu以時(shí)間依賴方式上調(diào)DDAH1 mRNA表達(dá)水平,提示乙?；瘏⑴c調(diào)節(jié)DDAH1表達(dá).同時(shí),研究結(jié)果顯示NaBu的作用于24 h達(dá)到峰值,48 h開始下降,這可能是由于NaBu長時(shí)間作用于細(xì)胞后某些負(fù)反饋抑制作用的結(jié)果.同時(shí)轉(zhuǎn)染野生型p300表達(dá)載體可顯著上調(diào)DDAH1mRNA表達(dá),而HAT結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300無此作用,說明p300對(duì)DDAH1的調(diào)節(jié)依賴于HAT結(jié)構(gòu)域,進(jìn)一步證明了乙?；瘜?duì)DDAH1表達(dá)的作用.Western b1ot的結(jié)果也證明NaBu和p300對(duì)DDAH1蛋白表達(dá)的作用,與它們對(duì)DDAH1mRNA水平的作用一致.

綜上所述,本研究證明了乙?；@一表觀遺傳學(xué)機(jī)制對(duì)DDAH1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,這一機(jī)制有可能通過影響NO水平而在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮一定的作用.當(dāng)然,本研究?jī)H鑒定了乙?；瘜?duì)DDAH1表達(dá)水平的影響,尚未闡明乙酰化調(diào)節(jié)其表達(dá)的具體機(jī)制,這將有待進(jìn)一步鑒定.

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(編輯武玉欣)

EffectofAcetylation on theExpression of DimethylarginineDimethylam inohydrolase1

WANGXi1,LIYing-hui2,CHENFang-jie2
(1.Mi1itaryWard,LiaoningProvincia1CorpsHospita1ofPAPF,Shenyang110034,China;2.DepartmentofMedica1Genetics,Co11egeofBasicMedica1Science,China Medica1University,Shenyang110122,China)

Objective Toassess theeffectofacety1ation on theexpression ofdimethy1argininedimethy1aminohydro1ase1(DDAH1)in human embryonic kidney(HEK)293 ce11s by using deacety1ase inhibitor sodium butyrate(NaBu)and acety1transferase p300 as the inducers of acety1ation. M ethods Rea1-time PCR was adopted to detect the changes of DDAH 1mRNA 1eve1 after the treatment of NaBu or with the transfection of wi1dtype or mutated p300 p1asmid.Western b1ot was carried out to assess the effect of NaBu or p300 on DDAH1 protein 1eve1.Results Resu1ts of rea1-time PCR showed that NaBu may up-regu1ate DDAH1mRNA 1eve1 in a time-dependent manner.Wi1d-type p300 significant1y increased the DDAH 1 mRNA expression,but mutant p300 showed 1ess effect.Western b1ot resu1ts demonstrated that NaBu and wi1d-type p300 may enhance DDAH1 protein expression,and no effect was observed with mutant p300,which was in accordance with their effects on DDAH1mRNA 1eve1. Conclusion Acety1ationmayup-regu1ate DDAH1mRNA and protein 1eve1in HEK293 ce11s.

dimethy1arginine dimethy1aminohydro1ase 1;sodium butyrate;p300;acety1ation

R394

A

0258-4646(2016)03-0230-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.010

遼寧省自然科學(xué)基金(2014021061)

王曦(1976-),男,主治醫(yī)師,本科. E-mai1:frankwang_1i@126.com

2015-03-15

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