CD40基因多態(tài)性與原發(fā)免疫性血小板減少癥的相關分析

魏　巖,何　娟,何　暉,屈慧麗,閆寒冰

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科,沈陽110001;2.本溪市中心醫(yī)院科研實驗室,遼寧本溪117000;3.本溪市中心醫(yī)院血液科,遼寧本溪117000)

CD40基因多態(tài)性與原發(fā)免疫性血小板減少癥的相關分析

魏巖1,何娟1,何暉2,屈慧麗3,閆寒冰3

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科,沈陽110001;2.本溪市中心醫(yī)院科研實驗室,遼寧本溪117000;3.本溪市中心醫(yī)院血液科,遼寧本溪117000)

目的探討CD40基因rs1883832和rs4810485位點的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與中國遼寧地區(qū)漢族人群成人原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)易感相關性.方法采取病對照研究方法,選取160例成人初診ITP住院患者(ITP組)和160例正常體檢者(對照組)為研究對象.利用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法測定2個SNP位點多態(tài)性分布,計算2組的基因型頻率和等位基因頻率.結果rs1883832位點ITP組的CC基因型及C等位基因頻率明顯高于對照組(均P< 0.05),TT基因型及T等位基因頻率低于對照組(均P<0.05).而rs4810485的基因型及等位基因頻率2組分布差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05).結論CD40基因SNP位點rs1883832的C等位基因多態(tài)性可能與中國遼寧地區(qū)漢族ITP發(fā)病相關,而SNP位點rs4810485與ITP發(fā)病無相關性.

CD40基因;原發(fā)免疫性血小板減少癥;單核苷酸多態(tài)性

網(wǎng)絡出版地址

原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)屬于自身免疫性疾病,又稱特發(fā)性血小板減少性紫癜,是臨床最常見的出血性疾病,約占出血性疾病的30%.研究[1]發(fā)現(xiàn)除體液免疫外,細胞免疫在ITP發(fā)病機制中的作用不容忽視,其中自身反應性T細胞的異常活化起著關鍵性作用,一旦自身免疫耐受機制被打破,它可輔助相同自身抗原特異性B細胞產(chǎn)生自身抗體導致自身免疫病ITP的發(fā)生.

CD40(Bp50)是與T細胞和B細胞功能有關的一種表面抗原,是分子質量為(45～50)X103的Ⅰ型跨膜糖蛋白,由277個氨基酸組成,包括細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內區(qū),它屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體家族細胞因子.CD40基因定位于20q11,屬于神經(jīng)生長因子受體/TNF受體超家族成員,主要表達于B細胞發(fā)育和分化的各個階段,單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞、樹突狀細胞和上皮細胞亦能表達CD40.有研究[2]顯示B細胞水平在ITP患者體內顯著高于正常組,B細胞表面CD40表達水平也顯著高于正常組.已證實[3～5]CD40基因多態(tài)性在系統(tǒng)性紅斑狼瘡,免疫性甲狀腺性疾病[6,7]、類風濕性關節(jié)炎[8]、川崎病[9,10]等免疫性疾病異常表達,本研究應用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態(tài)性(po1ymerase chain reaction-restriction fragment 1ength po1ymor phism,PCR-RFLP)方法進行研究,旨在探討CD40基因多態(tài)性與中國遼寧地區(qū)漢族人群ITP之間的關系,為ITP的預防提供分子流行病學實驗依據(jù).

1　材料與方法

1.1研究對象

經(jīng)患者知情同意,本研究征集了中國醫(yī)科大學本溪中心醫(yī)院2008年11月至2014年7月住院確診為ITP初診成人患者160例(病例組).男53例,女107例,平均年齡50歲.入選標準參照文獻[11]確定.選擇160例健康成年體檢者為對照組,男78例,女82例,平均年齡56歲.病例組與對照組均為遼寧漢族人群.

1.2研究方法

1.2.1外周血基因組DNA提取:在簽署知情同意書之后,抽取患者外周血3 mL,枸櫞酸鈉抗凝,在-20～-80℃的冰箱中凍存.應用血液基因組天根DNA提取試劑盒離心柱型提取基因組DNA.

1.2.2CD40基因rs1883832位點PCR擴增及基因型分析:引物由生工生物工程上海股份有限公司設計合成.上游引物序列,5′-CCCATGGGCACAGCAAG ATGCGTCCC-3′,下游引物序列,5′-CCCATGGGCC TTCTCATTCCCCACTC-3′.應用美國Gene Amp 9700PCR儀擴增目的片段,擴增條件為:95℃預變性10 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s共40個循環(huán);末次循環(huán)后72℃延伸7 min結束反應.用限制性內切酶NcoⅠ在37℃水浴16 h酶切PCR產(chǎn)物,2%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型.

1.2.3CD40基因rs4810485位點PCR擴增及基因型分析:引物由生工生物工程上海股份有限公司設計合成.上游引物序列,5′-ACCGTATCTTGGGTGTT CCA-3′,下游引物序列,5′-CTGCTTCCCTTGCTTT CCTT-3′.應用美國Gene Amp 9700PCR儀擴增目的片段,擴增條件為:95℃預變性10 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s共40個循環(huán);末次循環(huán)后72℃延伸7 min結束反應.用限制性內切酶Msp1在37℃水浴16 h酶切PCR產(chǎn)物,2%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型.

1.3統(tǒng)計學分析

所有結果應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析.以Hardy-Weinberg平衡檢驗分析研究樣本的群體代表性,計算每組的基因型頻率和等位基因頻率.計數(shù)資料采用χ2檢驗,以OR值及95%可信區(qū)間(95% CI)估計相對危險度.檢驗水準α=0.05.

2　結果

2.1兩位點的酶切結果

2.1.1rs1883832位點的酶切結果:CD40基因rs1883832位點上有C或T堿基的變化,根據(jù)限制性內切酶NcoⅠ酶切片段的情況基因型有3種:CC基因型(227 bp、105 bp 2條帶)、TT基因型(332 bp 1條帶)、CT基因型(332 bp、227 bp、105 bp 3條帶).見圖1.

圖1　NcoⅠ酶切rs1883832位點PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Identification of rs1883832 PCR p roducts by NcoⅠrestriction assay

2.1.2rs4810485位點的酶切結果:CD40基因rs4810485位點上有C或G堿基的變化,根據(jù)限制性內切酶Msp1酶切片段的情況基因型有3種:GG基因型(272 bp、163 bp 2條帶)、CC基因型(435 bp 1條帶)、CG基因型(435 bp、272 bp、163 bp 3條帶),見圖2.

圖2　Msp l酶切rs4810485位點PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 Identification o f rs4810485 PCR products by Mspl restriction assay

2.2兩位點的多態(tài)性分析

2.2.1rs1883832位點的多態(tài)性分析:ITP組的CC基因型及等位基因頻率明顯高于對照組(P均<0.05; ITP組的TT基因型及T等位基因頻率低于對照組(均P<0.05,表1).

2.2.2rs4810485位點的多態(tài)性分析:ITP組與對照組之間分布差異無統(tǒng)計學意義,等位基因頻率在2組間差異也無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,表2).

表2　ITP組與對照組rs4810485位點基因型及等位基因頻率的比較Tab.2Genotype distribution and allele frequency of the rs4810485 polymorphism in ITP and controls

3　討論

CD40基因rs1883832位點位于5′非翻譯區(qū)、mRNA翻譯起始密碼子ATG上游-1堿基處,CD40基因分布在質膜,參與免疫應答信號轉導過程.其配體CD40L,又名TRAP(TNF-re1ated activation ptotein),是腫瘤壞死因子家族成員之一.它們之間的相互作用不僅在體液免疫中扮演重要角色,而且在調節(jié)細胞介導的免疫應答中也發(fā)揮著重要的作用.CD40-CD40L交聯(lián)對B細胞的活化、增殖、抗體的產(chǎn)生以及Ig類別轉換都起了非常重要的作用.一方面,不僅CD40-CD40L交聯(lián)可以增加B細胞DNA的合成,引起靜止B細胞的復制,而且CD40單克隆抗體單獨也可以促使B細胞增殖,使B細胞表面多種黏附分子呈現(xiàn)高親和狀態(tài),從而導致細胞聚集,有助于T、B細胞的相互作用.通常血小板內和膜表面低表達CD154(CD40L),當血小板活化后其表達增加,這對于ITP的發(fā)病有重要意義:血小板表面的CD154與血小板上抗原(GPⅡb/Ⅲa等)一起為B細胞活化提供共刺激信號,且血小板源CD154能促進DC向成熟分化,上調DC共刺激分子的表達.在ITP患者體內血小板相關性CD154表達升高,且導致患者自身反應性B淋巴細胞異常活化.ITP患者外周血CD40及CD154表達升高,推測血小板相關的CD154表達升高可以誘導患者CD40依賴的自身反應性B淋巴細胞活化,在ITP發(fā)病中起重要作用.

Liu等[12]研究了CD40基因多態(tài)性在中國類風濕性關節(jié)炎患者中的易感性,表明CD40rs1883832可能與類風濕性關節(jié)炎相關.Prasad等[13]全基因組關聯(lián)研究和薈萃分析表明:在歐洲和亞洲的人口中, CD40基因與類風濕性關節(jié)炎具有相關易感性.在希臘和土耳其系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究中,CD40已經(jīng)被確定為一個新的易感性位點,潛在影響調節(jié)異常的免疫反應疾病.調查表明CD40基因rs4810485多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風險性增加有關.本文研究了遼寧漢族人群中ITP患者CD40基因rs1883832和rs4810485位點的多態(tài)性,結果表明SNP位點rs1883832與ITP易感性相關,推測可能的原因是影響CD40的表達量,進而影響CD40-CD40L等炎性信號反應通路,這一推測需要進一步的實驗證明.ITP患者CD40基因rs1883832位點的T堿基向C堿基的突變導致個體ITP易感傾向不同.目前認為,C等位基因能上調CD40在B淋巴細胞表達而T等位基因則相反,C等位基因可能是通過增加CD40的翻譯效率而導致對疾病的易感性.而SNP位點rs4810485位于CD40基因內含子上面,與ITP的易感不相關,可能原因是SNP不影響蛋白的功能和表達量.

鑒于本組研究涉及例數(shù)有限,研究中觀察到的結果有待擴大樣本進一步證實.我們尚需要加大樣本,從家系的角度不同地域、不同人種分析研究CD40基因多態(tài)性,同時聯(lián)合檢測相關基因多態(tài)性,分析相關基因聯(lián)合對ITP病的影響,以便提高個體ITP病易感性的預測水平,篩查高危人群,從而加強ITP的早期預防、診斷及判斷預后.

[1]凌云,阮長耿.自身反應性T細胞及共刺激分子CD28/CTLA-4/ B7、CD40/CD40L和ITP[J].國外醫(yī)學(輸血及血液學分冊), 2005,28(6):545-547.

[2]劉萊,錢毓晉,李莼華.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者B細胞CD40表達及臨床意義[J].中國血液流變學雜志,2006,16(4): 660-661.

[3]Piotrowski P,Lianeri M,Wudarski M,et a1.Sing1e nuc1eotide po1ymorphism of CD40 region and the risk of systemic 1upus erythematosus[J].Lupus,2013,22(3):233-237.

[4]Joo YB,Park BL,Shin HD,et a1.Association of genetic po1ymorphisms in CD40 with susceptibi1ity to SLE in the Korean popu1ation [J].Rheumato1ogy(Oxford),2013,52(4):623-630.

[5]Vazgiourakis VM,Zervou MI,Chou1aki C,et a1.A common SNP in the CD40 region is associated with systemic 1upus erythematosus and corre1ates with a1tered CD40 expression:imp1ications for the pathogenesis[J].Ann Rheum Dis,2011,70(12):2184-2190.

[6]Wang H,Zhu LS,Cheng JW,et a1.CD40 1igand induces expression of vascu1ar ce11 adhesion mo1ecu1e 1 and E-se1ectin in orbita1 fibrob1asts from patients with Graves'orbitopathy[J].Graefes Arch C1in Exp Ophtha1mo1,2015,253(4):573-582.

[7]Yamamoto K,Itoh M,Okamura T,et a1.Re1ative 1eve1s of the inf1ammatory cytokine TNFα and the so1ub1e CD40 1igand profi1e in serum corre1ate with the thyrotoxic of Graves'disease[J].Thyroid,2012, 22(5):516-521.

[8]Li G,Diogo D,Wu D,et a1.Human genetics in rheumatoid arthritis guides a high-throughput drug screen of the CD40 signa1ing pathway [J].P1os Genet,2013,9(5):e1003487.

[9]Peng Q,Chen CH,Wu Q,et a1.Meta-ana1yses of the associations of genome-wide association study-1inked gene 1oci with Kawasaki disease[J].Zhonghua Er Ke Za Zhi,2013,51(8):571-577.

[10]Onouchi Y,Ozaki K,Burns JC,et a1.A genome-wide association study identifies three new risk 1oci for Kawasaki disease[J].Nat Genet,2012,44(5):517-521.

[11]Rodeghiero F,Stasi R,Cernsheimer T,et a1.Standardization of termino1ogy,definitions and outcome criteria in immune thombocytopenic purpura of adu1ts and chi1dren:report from an internationa1 working group[J].B1ood,2009,113(11):2386-2393.

[12]Liu R,Xu N,Wang X,et a1.Inf1uence of MIF,CD40,and CD226 po1ymorphisms on risk of rheumatoid arthritis[J].Mo1 Bio1 Rep, 2012,39(6):6915-6922.

[13]Prasad P,Kumar A,Gupta R,et a1.Caucasian and Asian specific rheumatoid arthritis risk 1oci revea1 1imited rep1ication and apparent a11e1ic heterogeneity in north Indians[J].PLoS One,2012,7 (2):e31584.

(編輯武玉欣)

Correlation between CD40GenePolymorphism and Immune Thrombocytopenia

WEIYan1,HEJuan1,HEHui2,QUHui-1i3,YANHan-bing3
(1.Depatment of Hemato1ogy,The First Hospita1,China Medica1 University,Shenyang 110001,China;2.Scientific Research Laboratory,Benxi Centra1 Hospita1, Benxi117000,China;3.DepatmentofHemato1ogy,BenxiCentra1Hospita1,Benxi117000,China)

Objective To study the corre1ation between two sing1e nuc1eotide po1ymorphism(rs1883832 and rs4810485 in CD40 gene)and immune thrombocytopenia(ITP)in the Liaoning region of the Han Chinese adu1t.Methods A case-contro1 study was performed on 160 new1y diagnosed adu1t ITPpatientsand160norma1contro1s.Thepo1ymorphism oftwoSNPsin CD40 geneweredetected usingPCR-RFLP,eachgenotype frequency and a11e1e frequency was ca1cu1ated.Results The CC genotype and Ca11e1e in ITP group was higher than that in contro1(P<0.05).The TT genotype and T a11e1e in ITP group was significant1y 1ower than that in contro1(P<0.05).There was no significant difference in the genotype distribution ora11e1e frequencyofSNP rs4810485 in CD40 genebetween the ITPand norma1groups(P>0.05).Conclusion Thepo1ymorphism ofCa1-1e1e CD40 gene rs1883832maybe associatedwith ITPin LiaoningHan Chinese,whi1eSNPrs4810485maynot.

CD40 gene;immune thrombocytopenia;sing1e nuc1eotide po1ymorphism

R558.2

A

0258-4646(2016)03-0237-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.012

魏巖(1980-),女,主治醫(yī)師,本科.

何娟,E-mai1:hejuan-2006@126.com

2015-05-16

網(wǎng)絡出版時間: