GANT61對食管鱗癌細胞上皮-間質轉化作用的研究

王　雷,杜媛鯤,王　林,米　源,王　娜

(河北醫科大學1.第四醫院胸二科,石家莊050011;2.期刊社,石家莊050017;3.第四醫院河北省腫瘤研究所分子生物室,石家莊050011)

GANT61對食管鱗癌細胞上皮-間質轉化作用的研究

王雷1,杜媛鯤2,王林1,米源1,王娜3

(河北醫科大學1.第四醫院胸二科,石家莊050011;2.期刊社,石家莊050017;3.第四醫院河北省腫瘤研究所分子生物室,石家莊050011)

目的研究GANT61對人食管鱗癌細胞OE21和KYSE-30的上皮-間質轉化的影響,同時使用N-Shh蛋白刺激Hedgehog通路作為陽性對照,探討GANT61抗腫瘤機制.方法實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法檢測GANT61和N-Shh蛋白作用于OE21和KYSE-30細胞后G1i1、G1i2、N-cadherin和β-catenin基因變化;Western b1ot觀察藥物GANT61和N-Shh蛋白作用于OE21和KYSE-30細胞后對G1i1、G1i2、N-cadherin和β-catenin蛋白表達的影響.劃痕愈合試驗觀察GANT61和N-Shh蛋白作用于OE21和KYSE-30細胞后對細胞遷移侵襲能力的影響.結果實時熒光定量PCR結果顯示,GANT61可以下調OE21和KYSE-30的G1i-1、G1i-2、N-cadherin和β-cateninmRNA表達;Western b1ot顯示GANT61可以下調OE21和KYSE-30的G1i1、G1i2、N-cadherin和β-catenin蛋白表達.劃痕愈合試驗顯示GANT61導致OE21和KYSE-30細胞的遷移能力明顯下降.應用N-Shh蛋白可以上調OE21和KYSE-30的G1i1、G1i2表達,N-cadherin和β-catenin表達,同時促進OE21和KYSE-30的遷移能力.結論GANT61通過下調Hedgehog信號轉導通路中G1i1和G1i2的表達來影響食管鱗癌細胞上皮-間質轉化能力,G1i可成為抑制食管鱗癌細胞轉移新的有效的分子靶點.

食管鱗癌;Hedgehog信號通路;GANT61;G1i;上皮-間質轉化

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食管癌是最具有侵襲性的惡性腫瘤之一[1].我國是全球食管癌發病率和病死率最高的國家,每年因食管癌死亡病例超過15萬例,其中食管鱗癌占新發病例的90%.食管癌發病隱匿,多數患者確診時腫瘤已經浸潤轉移,傳統的放化療效果欠佳,因此找到參與食管鱗癌發生發展的主要因子或信號傳導通路,對食管鱗癌的防治和預后將具有重要的意義.近年來研究[2～5]發現異常激活的Hedgehog(Hh)信號通路對肺癌、腸癌、淋巴瘤、胰腺癌等多種腫瘤的發生發展和惡性生物學特性的維持起著關鍵作用.Hh信號傳導通路主要包括上游Hh配體、Patched受體、Smoothened蛋白和下游核轉錄因子G1i以及目的基因等,其中G1i在其通路中起到核心調控作用.

上皮-間質轉化(epithe1ia1 mesenchyma1 transition,EMT)是一個多步驟、多基因和多階段的復雜過程,是指上皮細胞在形態學上發生向間質細胞表型的轉變并獲得遷移的能力.這種轉化過程使上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力,是腫瘤復發和轉移的一個重要分子基礎[6].目前研究顯示食管鱗癌組織中存在上游Hh配體異?；罨臓顟B,但是關于食管鱗癌細胞中G1i的異常活化和EMT是否存在關系以及如何調控的相關機制目前國內外報道極少,本研究通過應用G1i的特異性抑制劑GANT61抑制人食管鱗癌細胞系OE21和KYSE-30中的G1i的表達,觀察其調控EMT的影響,為食管鱗癌的靶向治療提供新思路.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑:人食管鱗癌細胞系OE21和KYSE-30由河北省腫瘤研究所提供,F12(Ham)液體培養基(武漢博士德生物工程有限公司),RPMI1640培養液(美國Gibco公司),胰酶(美國Gemini公司),胎牛血清(美國Gemini公司),GANT61(美國Se11eckchem公司),N-Shh蛋白(美國Ebioscience公司),總RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司),cDNA合成試劑盒(美國Bio-Rad公司),Taqman基因表達預混液(美國App1ied Biosystems公司),G1i1引物和探針(Hs00171790,美國Life Techno1ogies公司),G1i2引物和探針(Hs01119974_m1,美國Life Techno1ogies公司),N-cadherin(Hs00983056_m1,美國Life Techno1ogies),β-catenin(Hs00355049_m1,美國Life Techno1ogies),GAPDH(Hs02758991_g1,美國Life Techno1ogies公司),Pierce-BCA蛋白分析試劑盒(美國Thermo Scientific公司),M-PER培養細胞總蛋白提取試劑(美國Thermo Scientific公司),蛋白酶抑制劑(德國Roche公司),G1i1兔抗人單克隆抗體(ab49314,美國Abcam公司),G1i2鼠抗人單克隆抗體(sc271786,美國Santa Cruz公司),N-cadherin兔抗人單克隆抗體(sc-7939,美國Santa Cruze公司),βcatenin鼠抗人單克隆抗體(ab92547,美國Abcam公司),GAPDH鼠抗人單克隆抗體(sc32233,美國Santa Cruz公司),Mini-PROTEAN TGX預制膠(美國Bio-Rad公司),Tris/甘氨酸/電泳緩沖液(美國Bio-Rad-公司),Tris/甘氨酸緩沖液(美國Bio-Rad公司).

1.1.2主要儀器:NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計(美國Thermo Scientific公司),ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀(美國App1ied Biosystems公司),Veriti?96-We11 Therma1 Cyc1er(美國App1ied Biosystems公司).

1.2方法

1.2.1細胞培養:細胞于37℃、5%CO2培養箱中孵育,OE21細胞培養于RPMI 1640培養液(含10%胎牛血清,青-鏈霉素各100 mg/mL)中,KYSE-30細胞培養于F12(Ham)和RPMI 1640培養液(1∶1)(含2%胎牛血清,青-鏈霉素各100 mg/m)中.

1.2.2實時熒光定量PCR法:將培養瓶中的細胞用0.25%胰酶消化,計數后按每孔0.1X106鋪于12孔板,第2天細胞培養至70%～80%融合時,換無血清培養基并加入GANT61(10 μmo1/L),同時設N-Shh蛋白組(0.5 mg/mL)和空白對照(DMSO)組,24 h后按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組RNA,用NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計檢測RNA濃度,采用美國Bio-Rad公司的反轉錄cDNA合成試劑盒(iScript cDNA Synthesis Kit)和Veriti?96-We11 Therma1 Cyc1er儀器進行cDNA反轉錄,反轉錄條件為25℃5 min,42℃30 min和85℃5 min.將反轉錄得到的cDNA用無RNase水稀釋10倍后按照cDNA4.5 μL、Taqman基因表達預混液5 μL以及G1i1、G1i2、N-cadherin、β-catenin GAPDH各自的引物和探針0.5 μL共10 μL/孔反應體系加樣于384孔板,應用ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀進行PCR檢測,PCR反應條件為95℃10 s,60℃10 s, 72℃10 s,共40個循環.讀取CT值后以GAPDH的CT值作為內參,采用2-ΔCt法進行數據分析.

1.2.3Western b1ot:將培養瓶中的細胞用0.25%胰酶消化,計數后按每孔0.3X106鋪于6孔板,第2天細胞培養至70%～80%融合時換無血清培養基時加入GANT61(10 μmo1/L),同時設N-Shh蛋白組(0.5 mg/mL)和DMSO組,24 h后用PBS洗滌3次細胞后加細胞蛋白提取液和蛋白酶抑制劑,收集每孔蛋白液后用BCA法測定蛋白濃度.在Mini-PROTEAN TGX預制膠中以每泳道10 μg行蛋白上樣,在電泳槽中經Tris/甘氨酸/電泳緩沖液SDS進行電泳使不同KD的蛋白分離,電泳條件200 V,40 min.電泳結束后在Tris-甘氨酸緩沖液中將蛋白電轉移印跡到PVDF膜上,實驗條件100 V,40 min.用5%脫脂奶粉/TBST液封膜1 h,一抗G1i1工作濃度為1∶1 000,一抗G1i2工作濃度為1∶250,一抗N-cadherin工作濃度為1∶250、一抗β-catenin工作濃度為1∶5 000,一抗GAPDH工作液濃度為1∶10 000,4℃過夜,第2天TBST洗膜3次,每次10 min,室溫孵育二抗1 h,羊抗兔或羊抗鼠二抗工作濃度均為1∶20 000,ECL試劑發光5 min后于暗室經X線曝光顯影.

1.2.4劃痕愈合試驗:于6孔板中培養細胞呈70%～ 80%融合生長時換無血清培養基,加入濃度為10 μmo1/L的GANT61處理24 h,同時設N-Shh蛋白組(0.5 mg/mL)和DMSO組,于各組的單細胞層上用200 μL的槍頭劃痕,繼續培養細胞.于劃痕后0 h和24 h在顯微鏡下組取4個視野拍照,用Image軟件測量0 h和24 h劃痕寬度的變化,用閉合率代表各組的細胞侵襲遷移能力,閉合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度X 100%.

1.3統計學方法

實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件進行處理,采用One-way AVONA檢驗方法.P<0.05為差異有統計學意義.

2　結果

2.1實時熒光定量PCR結果

GANT61作用于OE19細胞24 h后導致G1i-1 mRNA(P=0.005)、G1i2 mRNA(P=0.004)、N-cadherin(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)表達水平顯著低于DMSO組;與DMSO組相比,N-Shh蛋白可以上調G1i1 mRNA(P=0.000)、G1i2 mRNA(P= 0.003)、N-cadherin(P=0.004)、β-catenin(P= 0.001);GANT61作用于KYSE-30細胞24 h后導致G1i1 mRNA(P=0.005)、G1i2 mRNA(P=0.000)、N-cadherin(P=0.021)、β-catenin(P=0.000)的表達水平顯著低于DMSO組;與DMSO組相比,N-Shh蛋白可以上調G1i1 mRNA(P=0.004)、G1i2 mRNA(P= 0.000)mRNA、N-cadherin(P=0.002)、β-catenin(P= 0.01),差異有統計學意義,見圖1.

圖1　實時熒光定量PCR法檢測GANT61和N?Shh處理后OE21和KYSE?30細胞的m RNA水平Fig.1 m RNA level after treated by GANT61 or N?Shh as detected by real time PCR in OE21and KYSE?30 cell lines

2.2 Western b1ot結果

GANT61作用于OE21細胞24 h后G1i1、G1i2、N-cadherin和β-catenin蛋白表達量顯著低于DMSO,而內參GAPDH蛋白表達無明顯變化;GANT61作用于KYSE-30細胞后G1i1、G1i2、N-cadherin和β-catenin蛋白表達顯著低于DMSO,內參GAPDH蛋白表達無明顯變化;N-Shh蛋白作用于OE21和KYSE-30后G1i1、G1i2、N-cadherin和β-catenin蛋白表達顯著高于DMSO,見圖2,圖3.

圖2　W estern blo t方法檢測GANT61和N?Shh處理后OE21細胞的的蛋白表水平Fig.2 The protein expression after treated by GANT61 or N?Shh as detected by Western blot assay in OE21 cell line

圖3　W estern blo t方法檢測GANT61和N?Shh處理后KYSE?30細胞的的蛋白表達水平Fig.3 The protein expression after treated by GANT61 or N?Shh as detected by Western blot assay in KYSE?30 cell line

2.3劃痕愈合實驗

應用GANT61處理24 h后,OE21的侵襲遷移能力明顯受到抑制,所得數據經標準化處理后閉合率為DMSO組的46%,差異有統計學意義(P=0.000); N-Shh蛋白可以增加OE21的侵襲遷移能力,閉合率為DMSO組的120.67%,差異有統計學意義(P= 0.003).KYSE-30細胞處理組閉合率為DMSO組的54%,與DMSO組相比差異具有統計學意義(P= 0.000);N-Shh蛋白可以增加侵襲遷移能力,閉合率為DMSO組的141.33%,差異有統計學意義(P= 0.000),見圖4.

3　討論

食管癌的發生發展是一個多因素、多步驟的過程,與一些信號傳導通路的異常激活密切相關.經典的Hh信號傳導通路是過度表達的Hh結合跨膜受體Ptch后釋放了Ptch介導抑制的Smo受體,激活的Smo繼續活化G1i進入細胞核內促進Hh通路下游靶基因的轉錄.但是由于Hh/Smo和TGFb、EGFR、RAS和AKT/PI3K等一些腫瘤信號通路之間存在交叉傳導,導致G1i存在不依賴Hh激活的狀態[7,8],因此近年來研發的針對Hh通路上游靶點Smo的小分子靶向藥物Vismodegib[9],cyc1opamine[10]只能用于治療Hh通路的激活發生在Smo或其上游水平的腫瘤,而對其下游通路的激活所導致的腫瘤無效,所以有必要進一步發掘更具特異性和高效的治療靶點. G1i家族在Hh通路中起著核心作用,而且GANT61作為新研制的針對G1i1和G1i2靶點的Hh通路抑制劑在治療神經母細胞瘤[11]、粒細胞性白血病[12]、腸癌[3]等多種腫瘤顯示了良好的抗腫瘤效應,所以本研究從GANT61調控食管癌的G1i表達入手,探討了G1i表達和食管鱗癌細胞EMT的關系.

圖4　劃痕愈合實驗檢測GANT61和N?Shh處理后OE21和KYSE?30細胞的劃痕閉合率Fig.4 Wound?closure rates after treated by GANT61 or N?Shh as detected by Wound?healing assay in OE21and KYSE?30 cell lines

EMT是腫瘤細胞遷移、浸潤及轉移過程中的重要調控事件[13],是近年來抗腫瘤領域研究熱點之一.N-cadherin是鈣黏附家族的主要成分之一,被認為是間充質細胞的標記,在上皮細胞來源的腫瘤中N-cadherin的高表達是EMT的重要特征之一,與腫瘤生長侵襲和淋巴轉移密切相關[14].β-catenin也是EMT的生物標記物之一[15],它可以和LEF-1形成復合物去抑制E-cadherin的轉錄以及促進EMT[16].本研究結果顯示GANT61可以明顯下調OE21和KYSE-30細胞的G1i1、G1i2基因和蛋白表達,并且GANT61處理組N-cadherin和β-catenin基因和蛋白水平顯著低于DMSO組,同時為了刺激食管鱗癌細胞中Hh通路,本研究在實驗中同時應用了N-Shh蛋白,結果發現N-Shh可以上調G1i1和G1i2表達以及N -cadherin和β-catenin蛋白表達,細胞遷移實驗證實刺激Hh通路可以促進腫瘤細胞的侵襲能力,而應用GANT61后可以抑制腫瘤細胞的遷移能力.分析其原因可能是G1i通過上調N-cadherin和β-catenin表達誘導EMT進程,而GANT61通過特異性抑制G1i1和G1i2的表達從而下調食管癌EMT過程,降低癌細胞侵襲轉移能力.

總之,因為EMT的發生涉及多種信號轉導通路,與轉錄因子及腫瘤微環境等多因素有關,信號通路的關鍵組分可成為治療食管癌的潛在靶點.因為食管癌存在上皮-間質轉換,臨床上常伴有淋巴結轉移和血管浸潤現象,常規的手術和放、化療并沒有最終解決食管癌轉移和復發的問題,導致5年生存率多年徘徊在30%左右.本研究通過發現GANT61可以靶向性抑制G1i1和G1i2的表達從而調控食管癌細胞的EMT過程,為食管鱗癌的靶向治療提供新思路,期待G1i成為新的腫瘤治療靶點.

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(編輯于溪)

GANT61 InhibitsEpithelial-mesenchymal Transition in EsophagealSquamousCarcinoma

WANGLei1,DUYuan-kun2,WANGLin1,MIYuan1,WANGNa3
(1.Department of Thoracic Surgery,the Fourth Hospita1 of Hebei Medica1 University,Shijiazhuang 050011,China;2.Hebei Medica1 University Journa1 Department, Shijiazhuang050017,China;3.DivisionofMo1ecu1arBio1ogy,HebeiCancer Institute,the Fourth Hospita1ofHebeiMedica1University,Shijiazhuang050011,China)

Objective To investigate the effect of GANT61 on epithe1ia1-mesenchyma1 transition in the human esophagea1 squamous carcinoma ce11 1ines OE21 and KYSE-30 and e1ucidate its mechanism.Simu1taneous1y N-Shh proteins were app1ied to stimu1ate the Hedgehog pathway so as to eva1uate theanti-tumorgenesiseffectofGANT61.Methods ThemRNA expression of G1i1 and G1i2weredetected after treatmentofGANT61 orNShh by rea1 time f1uorescence quantitative PCR.The protein expression of N-cadherin and β-catenin were observed after treatment by Western b1ot assay.Wound-hea1ing Assay was performed to assess the effect of GANT61 and N-Shh on migration.Results Rea1 time f1uorescence quantitative PCR revea1ed that GANT61 cou1d inhibit the mRNA expression of G1i1,G1i2,N-cadherin andβ-catenin in OE21 and KYSE-30 ce11 1ines.Western b1ot assay showed that GANT61 reduced the protein expression of G1i1、G1i2,N-cadherin and β-catenin in OE21 and KYSE-30 ce11 1ines.Compared with contro1 group,GANT61 dramatica11y inhibited the capabi1ity of migration in both OE21 and KYSE-30 by wound-hea1ing assay.N-Shh proteins cou1d increase ce11 migration and up-regu1ated G1i1 and G1i2,N-cadherin and β-catenin mean and protein expression in OE21 and KYSE-30 ce11 1ines.Conclusion GANT61 cou1d effective1y inhibit EMT in esophagea1 squamous carcinoma by diminishing the expression of G1i1 and G1i2.G1icou1d beanew and potentmo1ecu1artarget fortreating theesophagea1squamous carcinoma.

esophagea1 squamous carcinoma;Hedgehog signa1 transduction pathway;GANT61;G1i;epithe1ia1-mesenchyma1 transition

R665.3

A

0258-4646(2016)03-0249-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.015

河北省科技廳科技計劃(132077127D)

王雷(1976-),男,副教授,博士. E-mai1:yuankundu@163.com

2015-09-10

網絡出版時間: