可溶性CD40配體對K562細胞增殖及生存素mRNA 和IL-8表達的影響*

封忠昕，吳燕梅，陳　琦，肖建輝，馮　進（.遵義醫學院附屬醫院檢驗科，貴州 遵義563003；.荷澤市立醫院老年科，山東703；3.遵義醫學院附屬醫院血液內科，貴州遵義563003；.貴州省細胞工程重點實驗室，遵義563003）

·論著·

可溶性CD40配體對K562細胞增殖及生存素mRNA 和IL-8表達的影響*

封忠昕1，吳燕梅2，陳琦3△，肖建輝4，馮進1
（1.遵義醫學院附屬醫院檢驗科，貴州 遵義563003；2.荷澤市立醫院老年科，山東274031；3.遵義醫學院附屬醫院血液內科，貴州遵義563003；4.貴州省細胞工程重點實驗室，遵義563003）

目的探究可溶性CD40配體（sCD40L）對人白血病K562細胞增殖、生存素（survivin）mRNA表達和白介素8（IL-8）表達水平的影響。方法采用噻唑藍（MTT）法檢測sCD40L對K562細胞增殖的影響，通過RT-PCR檢測survivin mRNA表達水平，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定IL-8表達情況。結果不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）對K562細胞增殖均有抑制作用，且可降低survivin mRNA及IL-8的表達水平；sCD40L細胞組細胞增殖抑制率高于K562細胞組，survivin mRNA及IL-8表達水平均低于K562細胞組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且呈劑量-時間依賴性。結論sCD40L在體外能夠明顯抑制K562細胞增殖，具有劑量-時間依賴性，sCD40L抑制K562細胞增殖可能與survivin mRNA及IL-8表達水平下調相關。

K562細胞；細胞增殖；survivin基因；白細胞介素8；可溶性CD40配體

慢性粒細胞白血病（chronicmyelocyticleukemia，CML）是一種常見的骨髓異常增殖性血液惡性腫瘤，臨床主要表現為脾大，易見Ph染色體和BCR-ABL融合基因，可分為慢性期、加速期和急變期。伊馬替尼是第一個治療CML的靶向藥物，但其越來越嚴重的耐藥性成為臨床和科研需要面對的極大挑戰［1-3］，因此，對CML的生物學研究是較為熱門的課題。

可溶性CD40配體（sCD40L）屬于腫瘤壞死因子（TNF）基因超家族成員之一，其在腫瘤細胞抗原遞呈等方面發揮著重要作用。sCD40L可顯著抑制B淋巴細胞白血病及多發性骨髓瘤細胞增殖，使腫瘤細胞呈現G1期阻滯，從而誘導腫瘤細胞的凋亡［4-5］。作者前期研究發現，不同濃度的sCD40L干預HL-60細胞時，CD95表達水平上調，Bcl-2表達水平下調，其原因可能是通過死亡受體途徑和線粒體途徑促進凋亡［6］。本研究通過測定生存素（survivin）mRNA及細胞培養液上清液中白介素 8（IL-8）的表達水平，探討不同濃度sCD40L對人白血病K562細胞的影響，從而探討其可能的作用機制，為人重組sCD40L能否應用于白血病的治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料人白血病K562細胞株（中國科學院上海生命研究院細胞資源中心），胎牛血清和RPMI1640（美國Gibico公司），sCD40L（以色列ProSpec公司），RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒及survivin引物（TaKaRa生物工程公司），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養將K562細胞培養于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養基中，置37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組（1）K562細胞組：不加任何藥物干預組；（2）sCD40L細胞組：sCD40L濃度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL；（3）空白調零組：僅加入 RPMI1640完全培養基（含10%FBS）。

1.2.3噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖取對數生長期的K562細胞（細胞活力大于90%）加入96孔培養板中，每孔細胞1×105（100 μL），總體積為200 μL。每組設5個復孔，用完全培養液（RPMI1640培養液加10%FBS）調整培養體積200 μL，在37℃、5%CO2的培養箱中培養24h，在終止培養前4h每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，培養終止后棄上清液，每孔用150μL二甲基亞砜（DMSO）溶解甲臢顆粒，輕輕振搖10 min，測定光密度（OD）值，檢測波長570 nm。計算公式：抑制率=（1-sCD40L細胞組OD值）/K562細胞組OD值×100%。

1.2.4survivin mRNA表達水平測定按照說明書提取各濃度、各時間段的細胞RNA，并進行逆轉錄反應。反應體系：5×Prime ScriptTMBuffer（for Real Time）6.0 μL，Prime Script TMRT Enzyme MixⅠ1.5 μL，Random 6 mers （100 μmol/L）1.5 μL，Oligo Dt Primer（50 μmol/L）1.5 μL，TotalRNA 19.5 μL，總體積30 μL。逆轉錄反應條件37℃15min，85℃5 s滅活逆轉錄酶。將逆轉錄產物cDNA放置-20℃冰箱保存。按照說明書進行RT-PCR，取1 μL逆轉錄產物cDNA進行PCR擴增。反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM10 μL，引物混合液（上、下游引物）1 μL，0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）8 μL，總體積20 μL。預變性95℃30 s 1個循環；PCR反應95℃5 s，60℃30 s，40個循環。survivin（NM_00101 2271.1）：上游引物5′-GTCTGGCGTAAGATGATGGATTTG-3′，下游引物3′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-5′；β-actin（NM_ 001101.3）：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGATGAA-3′，下游引物3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。實驗結果以2-△△Ct相對值計算mRNA表達情況。

1.2.5IL-8水平測定嚴格按照IL-8 ELISA試劑盒說明書的操作步驟進行操作。酶標包被板上分別設置空白孔、標準孔、待測樣品孔，分別加入細胞培養液、稀釋后的標準品、待測樣品上清液各100 μL，每孔均設置5個復孔。在37℃反應120min，加入一抗，37℃反應60min，洗滌后加入酶標抗體工作液，37℃反應30 min，洗滌后加入底物工作液，37℃反應15 min，最后加入終止液，用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度。

1.3統計學處理應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1sCD40L對K562細胞增殖的影響不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）作用K562細胞24、48、72 h后，隨著sCD40L濃度的增加及作用時間的延長，K562細胞增殖抑制率隨之升高，且與K562細胞組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　sCD40L不同作用時間對K562細胞增殖的抑制情況（±s，%，n=5）

表1　sCD40L不同作用時間對K562細胞增殖的抑制情況（±s，%，n=5）

注：與K562細胞組比較，aP＜0.05。

組別2 4 h 　4 8 h 　7 2 h K 5 6 2細胞組s C D 4 0 L細胞組（μ g / m L ）0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 8 . 9 6 ± 0 . 2 3a1 8 . 5 6 ± 0 . 7 2a2 6 . 8 7 ± 0 . 6 5a3 9 . 3 1 ± 0 . 5 8a5 4 . 2 6 ± 0 . 9 6a3 . 1 2 ± 0 . 1 5a9 . 2 5 ± 0 . 5 3a1 4 . 0 3 ± 0 . 2 2a2 2 . 3 3 ± 0 . 2 7a3 2 . 1 7 ± 0 . 3 9a6 . 2 3 ± 0 . 2 7a1 3 . 7 2 ± 0 . 3 4a2 0 . 5 6 ± 0 . 4 3a2 8 . 7 9 ± 0 . 3 2a4 1 . 3 6 ± 0 . 7 6a

2.2sCD40L對K562細胞survivin mRNA表達水平的影響不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）作用K562細胞24、48、72 h后，隨著sCD40L濃度的增加及作用時間的延長，survivin mRNA表達水平隨之降低，與K562細胞組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　sCD40L不同作用時間對K562細胞survivinmRNA表達水平的影響（±s，n=5）

表2　sCD40L不同作用時間對K562細胞survivinmRNA表達水平的影響（±s，n=5）

注：與K562細胞組比較，aP＜0.05。

組別2 4 h 　4 8 h 　7 2 h K 5 6 2細胞組s C D 4 0 L細胞組（μ g / m L ）0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 1 0 3 1 . 5 4 ± 7 7 . 6 3 1 0 6 3 . 6 2 ± 6 5 . 9 1 1 2 9 8 . 2 3 ± 7 7 . 1 0 1 0 4 1 . 7 1 ± 7 1 . 2 5a9 6 8 . 1 7 ± 5 5 . 9 4a8 9 7 . 0 5 ± 5 8 . 2 2a7 3 5 . 9 2 ± 5 0 . 3 8a5 4 6 . 5 3 ± 2 6 . 7 8a9 6 0 . 0 3 ± 6 1 . 7 6a8 6 2 . 6 5 ± 4 7 . 8 5a7 6 9 . 1 2 ± 2 9 . 9 3a6 0 5 . 4 5 ± 3 2 . 0 5a4 6 7 . 3 2 ± 1 4 . 5 9a9 9 3 . 9 7 ± 5 9 . 4 4a9 0 1 . 2 1 ± 6 6 . 3 2a8 4 6 . 3 6 ± 5 6 . 6 1a6 7 3 . 1 6 ± 4 4 . 6 7a4 9 8 . 6 4 ± 5 2 . 1 3a

2.3sCD40L對K562細胞培養上清液中IL-8表達水平的影響不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/mL）作用K562細胞24、48、72 h后，隨著sCD40L濃度的增加及作用時間的延長，IL-8表達水平隨之降低，與K562細胞組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3　sCD40L對K562細胞IL-8表達水平的影響（±s，n=5）

表3　sCD40L對K562細胞IL-8表達水平的影響（±s，n=5）

注：與K562細胞組比較，aP＜0.05。

組別2 4 h 　4 8 h 　7 2 h K 5 6 2細胞組s C D 4 0 L細胞組（μ g / m L ）0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 1 0 3 1 . 5 4 ± 7 7 . 6 3 1 0 6 3 . 6 2 ± 6 5 . 9 1 1 2 9 8 . 2 3 ± 7 7 . 1 0 1 0 4 1 . 7 1 ± 7 1 . 2 5a9 6 8 . 1 7 ± 5 5 . 9 4a8 9 7 . 0 5 ± 5 8 . 2 2a7 3 5 . 9 2 ± 5 0 . 3 8a5 4 6 . 5 3 ± 2 6 . 7 8a9 6 0 . 0 3 ± 6 1 . 7 6a8 6 2 . 6 5 ± 4 7 . 8 5a7 6 9 . 1 2 ± 2 9 . 9 3a6 0 5 . 4 5 ± 3 2 . 0 5a4 6 7 . 3 2 ± 1 4 . 5 9a9 9 3 . 9 7 ± 5 9 . 4 4a9 0 1 . 2 1 ± 6 6 . 3 2a8 4 6 . 3 6 ± 5 6 . 6 1a6 7 3 . 1 6 ± 4 4 . 6 7a4 9 8 . 6 4 ± 5 2 . 1 3a

3　討　論

CML是起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，也是臨床上常見的血液惡性腫瘤，病情進展緩慢，臨床表現主要為脾大、低熱、乏力、盜汗、體質量減輕等。CML在各年齡段均可發病，以中年居多，且男性多于女性，一般中位生存期為3～4年，對于CML的治療及其分子生物學研究是較為熱門的方向。

CD40L主要來源于血小板、B細胞、T細胞等，可分為sCD40L和膜結合型CD40配體2種［7］。sCD40L主要來源于血小板和T淋巴細胞。sCD40L是由膜結合型CD40配體裂解而成的，相對分子質量為18×103，主要以活化三聚體的形式存在，通常認為該配體存在2個功能區：一個是賴氨酸-精氨酸-谷氨酸（KGD）序列，其與血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體相結合；另一個是TNF同源結構域，其與CD40相結合［8］。對于sCD40L的研究多集中于肺癌、胃癌等實體瘤。劉珊等［9］將sCD40L聯合長春瑞濱作用于肺腺癌A549細胞，結果發現sCD40L可抑制A549細胞的體外增殖，但不顯著增加長春瑞濱誘導的細胞凋亡率，且對周期時相影響不大，推測其可能是通過凋亡及周期抑制以外的其他機制影響長春瑞濱對A549細胞的作用。但也有學者持不同觀點，王天立等［10］將sCD40L作用于肺腺癌A549細胞發現，sCD40L可引起A549細胞的生長抑制、細胞周期和表型改變，并可引起部分凋亡基因表達的改變。Li等［4］將sCD40L作用于胃癌細胞株AGS和BGC-823，發現誘導細胞凋亡和細胞周期調控可能成為治療胃癌的新手段。Aldinucci等［12］認為，sCD40L為B細胞惡性腫瘤提供了一種新的靶向治療可能。本研究表明，各濃度的sCD40L作用24、48、72 h后，細胞增殖抑制率均較K562細胞組明顯提高，差異均有統計學意義（P＜0.05），以2.5 μg/mL sCD40L作用72 h抑制率最顯著，提示sCD40L能夠抑制K562細胞增殖，且呈劑量-時間依賴性，因此可能具有抗白血病效應。有研究表明，CD40抗原與其配體CD40L配基化作用，可促進慢性B淋巴白血病細胞的抗凋亡基因survivin mRNA表達，也有研究發現白血病細胞在CD40刺激下可分泌趨化因子IL-8、IL-12等［5，11］。

survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）中相對分子質量最小的新成員，在正常的成熟組織中不表達或低表達。在病理狀態下，survivin廣泛表達于人類各種惡性腫瘤組織中，如胃癌、大腸癌、白血病和淋巴瘤等［12-13］。

本研究表明，不同濃度sCD40L作用于K562細胞24、48、72 h后，survivin mRNA表達水平較K562細胞組均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），且以2.5 μg/mL sCD40L作用72 h時survivin mRNA表達水平最低，具有劑量-時間依賴性，說明sCD40L在體外能夠抑制K562細胞增殖可能與survivin mRNA表達下調有關，這一結果與小檗堿（黃連素）和甘珀酸能減少K562細胞中survivin mRNA的表達一致［14-15］。

IL-8最初被命名為粒細胞激活因子，后被證實其性質為IL，屬于CXC類趨化因子。有研究發現，IL-8在多種惡性腫瘤組織中高表達，且與腫瘤的血管形成、生長，腫瘤轉移、復發等密切相關［16-17］。而本研究結果顯示，sCD40L作用于K562細胞24、48、72 h后，IL-8的表達水平較K562細胞組均有所降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），以2.5 μg/mL sCD40L作用72 h時IL-8表達水平降低，且具有劑量-時間依賴性，推測sCD40L在體外能夠抑制K562細胞增殖，可能與IL-8表達下調有關。

總之，不同濃度的sCD40L作用于K562細胞24、48、72 h后細胞增殖抑制率均有所上升，survivin mRNA和IL-8表達水平均有所下調，均具有劑量-時間依賴性，提示sCD40L對K562細胞增殖抑制可能與survivin mRNA及IL-8的表達下調有關，推測sCD40L有可能成為CML治療的新思路。然而，本研究僅對體外培養的K562細胞進行研究，且實驗重復次數和細胞種類有限，具有一定局限性。因此，sCD40L在體內抗CML效果如何，是否產生耐藥性等諸多問題需得進一步探討。

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Effect of soluble CD40 ligand on proliferation of K562 cells and expression level of survivin mRNA*

Feng Zhongxin1，WuYanmei2，Chen Qi3△，Xiao Jianhui4，Feng Jin1（1.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Department of Geriatrics，Heze Municipal Hospital，Heze，Shandong 274031，China；3.Department of Hematology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；4.Guizhou Provincial Key Laboratory of Cellular Engineering，Zunyi，Guizhou 563003，China）

ObjectiveTo investigate the effect of soluble CD40 ligand（sCD40L）on the proliferation of human leukemia K562 cells and expression levels of surviving mRNA and IL-8.MethodsThe MTT assay was used to examine the effect of different concentrations of sCD40L on the cellular proliferation，RT-PCR was used to determine the expression level of survivin mRNA；ELISA was used to detect the IL-8 expression.ResultsDifferent concentrations of sCD40L（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μg/mL）all had the inhibiting effect on K562 cell proliferation，moreover could decrease the expression levels of survivin and IL-8；the cellular proliferation inhibiting rate of the sCD40L cell group was higher than that of the K562 cell group，while the expression levels of surviving mRNA and IL-8 were lower than those in the K562 cell group，the difference was statistically significant（P＜0.05），moreover which showed the dose and time dependent manner.ConclusionsCD40L can significantly inhibit the proliferation of K562 cells in vitro with the dose and time dependent manner，sCD40L inhibiting the K562 cell proliferation is correlated with the down-regulation of surviving mRNA and IL-8 expression.

K562 cells；Cell proliferation；Survivin gene；Interleukin-8；Soluble CD40 ligand

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.001

A

1009-5519（2016）04-0481-03

貴州省社會發展攻關項目（黔科合SY字［2014］3025號）。

封忠昕（1978-），碩士研究生，主要從事惡性血液病的診治工作。

△，E-mail：zyfychenqi@163.com。

（2015-04-21

2015-09-01）