EGFL7在鼻咽癌組織中的表達研究

趙燕戀，楊繼紅，盧永田，張　娟，苗芳芳，李潔萍（.深圳大學附屬羅湖醫院，廣東深圳58000；.深圳市第二人民醫院，廣東58000）

EGFL7在鼻咽癌組織中的表達研究

趙燕戀1，楊繼紅1，盧永田2，張娟1，苗芳芳1，李潔萍1
（1.深圳大學附屬羅湖醫院，廣東深圳518000；2.深圳市第二人民醫院，廣東518000）

目的觀察表皮生長因子樣結構域7（EGFL7）在鼻咽癌中的表達，探討其臨床意義。方法采用免疫組織化學方法檢測2010年7月至2013年7月該院40例鼻咽癌患者蠟塊標本（研究組）及20例鼻咽炎患者炎癥組織（對照組）中EGFL7的表達；采用CD31抗體標記通過免疫組織化學方法檢測研究組及對照組的微血管密度（MVD），并分析EGFL7的表達與腫瘤臨床分期及MVD的相關性。結果兩組EGFL7陽性表達率均很高（研究組為92.5%，對照組為85.0%），但二者比較，差異無統計學意義（P＞0.05），研究組中EGFL7高表達率（37.9%）高于對照組（10.0%），差異有統計學意義（P＜0.05）；研究組中EGFL7的表達與患者性別、年齡、EB病毒抗體無相關性（P＞0.05）；與EGFL17表達高低、臨床分期及淋巴結轉移有關（P＜0.05）。Pearson相關分析發現，EGFL7表達與MVD值呈正相關（r=0.700，P=0.000）。結論EGFL7在鼻咽癌細胞中有表達，并與鼻咽癌的生長和浸潤轉移關系密切；其可能通過影響血管的生成參與鼻咽癌的發展，有可能成為反映鼻咽癌轉移及預后的標志物之一。

鼻咽腫瘤；表皮生長因子；結構域；毛細血管；腫瘤轉移

表皮生長因子樣結構域7（EGFL7）是一種內皮細胞特異性分泌因子，參與血管管腔的形成，腫瘤中有大量的新生血管，因此阻斷新生血管EGFL7的表達可抑制腫瘤的生長和轉移［1］。近年來有研究發現，EGFL7除限定于血管內皮系統外，在一些腫瘤細胞中也有表達。如上皮來源的腎癌［2］、喉癌［3-4］、胃癌［5］、乳腺癌［6］、肺癌［7］、肝癌［8］，以及間葉來源的人腦膠質瘤［9］等已有相關報道，但在鼻咽癌中是否表達鮮有相關報道。鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一，病因與種族易感性、遺傳因素及EB病毒感染等有關，是較為特殊的上皮源性惡性腫瘤，也是黏膜上皮在鱗狀上皮化生的基礎上癌變形成的，含有豐富的淋巴組織，具有較強的免疫應答。但迄今為止，鼻咽癌缺乏敏感性、特異性高的標志物。本研究運用免疫組織化學（免疫組化）方法檢測鼻咽癌（研究組）與鼻咽炎（對照組）組織中EGFL7的表達，采用CD31抗體進行免疫組化檢測研究組及對照組的微血管密度（MVD），探討EGFL7在鼻咽癌中的表達及其臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集本院2010年7月至2013年6月40例鼻咽癌患者的蠟塊標本作為研究組，以同期20例鼻咽炎患者炎癥組織作為對照組。研究組患者中男33例，女7例；有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移24例。依據鼻咽癌2008分期標準：Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ、Ⅳ期8例。對照組患者鼻咽炎包括以慢性炎癥為主的慢性鼻咽炎及以腺體、淋巴增生為主的腺樣體肥大。

1.2試劑及方法

1.2.1實驗試劑及儀器兔抗人EGFL7單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體（英國Abcam公司），山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體、抗體稀釋液（北京中杉金橋生物技術有限公司），DAB濃縮加強型試劑盒（廣州深達生物制品技術有限公司），組織切片機（Leica公司），顯微鏡（OLYMPUS公司），染色劑（SAKURA公司）。

1.2.2方法

1.2.2．1CD31、EGFL7免疫組化法檢測具體步驟：所有標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片。切片后放入65℃烤箱2 h，二甲苯3缸，每缸10 min，脫蠟；梯度乙醇水化，蒸餾水洗3 min，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復3 min，自然冷卻至室溫；3%過氧化氫溶液抑制內源性過氧化物酶：室溫放置10 min；以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）沖洗2min，共5次；Anti-CD31抗原、Anti-EGFL7抗原分別用抗體稀釋液以1∶100稀釋，均于4℃孵育過夜，PBS沖洗2 min，共5次，山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體于37℃孵育30 min；PBS沖洗2 min，共5次；DAB顯色3 min；蘇木素復染1 min，鹽酸乙醇分化5 s，蒸餾水返藍1 min。梯度乙醇脫水﹑二甲苯透明﹑中性樹膠封片。

1.2.2.2判斷標準EGF7為細胞質染色，評分標準參照Shimizu方法。（1）染色程度：細胞質無顯色為0分；細胞質呈云霧狀淡黃色為1分；細胞質呈黃色顆粒狀為2分；細胞質均勻深黃色為3分；（2）陽性細胞所占比例：陽性細胞數小于或等于10%為0分；＞10%～40%為1分；＞40%～70%為2分；＞70%為3分。（3）總積分為著色強度評分與陽性細胞所占比例評分之和；（4）總積分0分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。（5）總積分大于或等于3分為高表達，＜3分為低表達。根據Vimtemin結果評判：細胞質染色出現棕黃色為陽性，每張切片隨機觀察5個高倍視野，計數500個細胞中染色陽性的細胞，陽性細胞小于或等于10%為陰性，＞10%為陽性。

1.2.2.3MVD測定MVD計數：在200倍鏡下隨機記錄5個視野血管數，取平均值進行統計學處理。

1.3統計學處理應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗；采用Pearson相關性檢驗，檢驗水平α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1兩組EGFL7表達情況研究組陽性表達37例（92.5%），對照組陽性表達17例（85.0%），兩組EGFL7陽性表達率均較高，但二者比較，差異無統計學意義（χ2=0.208，P＞0.05）。研究組高表達25例（62.5%），對照組中高表達2例（10.0%），兩組比較，差異有統計學意義（χ2=4.966，P＜0.05）。見圖1、表1。

2.2兩組MVD表達情況研究組MVD均值為（67.008± 22.122），對照組為（71.420±16.187），兩組比較，差異無統計學意義（t=-0.791，P＞0.05）。但研究組中EGFL7高表達、有淋巴結轉移及臨床分期高（Ⅲ期）的標本中MVD值較低表達、無淋巴結轉移及臨床分期低（Ⅰ～Ⅱ期）標本高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。研究組中各組MVD情況見表2，圖2、3。

圖1　EGFL7在鼻咽癌及鼻咽炎中的表達（200×）

表1　EGFL7與研究組鼻咽癌組織臨床病理特征的關系［n（%）］

表2　研究組中MVD與EGFL7、淋巴結轉移情況及臨床分期的相關性±s）

表2　研究組中MVD與EGFL7、淋巴結轉移情況及臨床分期的相關性±s）

M V D分組n t P E G F L 7低表達E G F L 7高表達有淋巴結轉移無淋巴結轉移T N M分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ2 5 1 5 1 6 2 4 5 5 . 0 8 8 ± 1 7 . 2 7 5 8 6 . 8 7 3 ± 1 3 . 2 3 7 8 1 . 2 1 9 ± 2 0 . 9 6 5 5 7 . 5 3 3 ± 1 7 . 5 8 0 -6 . 1 1 8 0 . 0 0 0 -3 . 8 6 5 0 . 0 0 0 3 2 8 6 2 . 6 5 3 ± 2 2 . 1 9 6 8 4 . 4 2 5 ± 1 0 . 5 5 5 -2 . 6 8 0 0 . 0 1 1

圖2　研究組EFGL7高、低表達組中CD31標記的MVD結果（200×）

圖3　研究組有、無淋巴結轉移組中CD31標記的MVD結果（200×）

2.3研究組鼻咽癌組織中MVD與EGFL7表達的相關性分析經Pearson分析發現，鼻咽癌組織中MVD值與EGFL7的表達呈正相關（r=0.700，P=0.000）。見圖4。

圖4　研究組鼻咽癌組織中MVD與EGFL7表達的相關性散點圖

3　討　論

以往研究大多以腫瘤與正常組織進行對比，但鑒于倫理問題，不可能取正常組織標本作為實驗對照，即便是癌旁組織，其血供也相當豐富。本研究以鼻咽癌患者標本為研究組，以同期鼻咽炎患者炎癥組織作為對照組。過去研究認為，EGFL7的表達僅限于血管內皮系統，但目前部分研究發現，一些腫瘤細胞也可表達EGFL7。本研究檢測結果顯示，EGFL7在鼻咽癌細胞中及炎癥組織中陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；其原因可能是鼻咽部位特殊，本身富含血管及淋巴管，鼻咽炎中血管豐富，而EGFL7在血管內皮有較強的表達，所以鼻咽炎組織中EGFL7的陽性表達高。但鼻咽癌組織中的EGFL7高表達率要高于鼻咽炎組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明不僅血管內皮系統有EGFL7，鼻咽癌細胞中也有表達EGFL7的可能。本研究結果顯示，在鼻咽癌細胞質中有EGFL7的表達正好詮釋這點。另外，本研究發現，研究組中EGFL7表達水平與MVD呈正相關（r=0.700，P=0.000），且鼻咽癌組織中EGFL7的表達還與臨床分期及淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。作者推測，EGFL7可能通過影響血管的生成參與鼻咽癌的發展。鼻咽癌的侵襲生長高度依賴于新生血管，其可以從中獲取營養物質，同時鼻咽癌周圍的血管改變構成了一個有利于腫瘤生長的微環境，促進腫瘤的生長與侵襲，鼻咽癌的侵襲、轉移與血管新生是相互作用、相互依存的［10-11］。EGFL7在鼻咽癌中的作用機制可能是腫瘤內皮細胞通過分泌的EGFL7蛋白易化腫瘤細胞內滲入血流中；同時微血管內皮細胞也表達EGFL7蛋白，并且從血流中捕獲腫瘤細胞，易化腫瘤細胞以血管外滲方式進入新的組織器官［1，12］。隨著鼻咽癌臨床及病理級別的增加，其血管新生的活躍程度也增加，EGFL7的表達也隨著腫瘤浸潤程度加深而增加［13］。

綜上所述，EGFL7的表達與鼻咽癌及其浸潤、轉移有密切關系，EGFL7可能成為反映鼻咽癌轉移及預后的標志物之一，但要作為鼻咽癌的特異性抗體有待于進一步考證。鼻咽癌的侵襲、轉移除了血行轉移外，還可通過淋巴途徑，尤其對于鼻咽癌，淋巴轉移尤為重要；而且鼻咽癌是較為特殊的上皮源性惡性腫瘤，不僅血管豐富，其上皮下是更為豐富的淋巴組織，具有較強的免疫應答［14-15］。那么EGFL7在淋巴內皮中是否也有表達，EGFL7是否對血管、淋巴管具有雙重作用，也可能成為新的研究亮點。

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Study on expression of EGFL7 in nasopharyngeal carcinoma tissue

Zhao Yanlian1，Yang Jihong1，Lu Yongtian2，ZhangJuan1，Miao Fangfang1，Li Jieping1（1.Affiliated Luohu Hospital of Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518000，China；2.Shenzhen Municipal Second People′s Hospital，Shenzhen，Guangdong 518000，China）

ObjectiveTo observe the epidermal growth factor structure domain 7（EGFL7）expression in nasopharyngeal carcinoma（NPC），and to explore its clinical significance.MethodsThe immunohistochemical method was used to detect the EGFL7 expression in 40 NPC tissue paraffin samples（study group）and 20 nasopharyngitis tissue samples（control group）in our hospital from July 2010 to July 2013；the CD31 antibody labeling immunohistochemical method was adopted to detect the microvas cular density（MVD）in the study group and control group，then the correlation between the EGFL7 expression with tumor clinical stage and MVD was analyzed.ResultsThe EGFL7 positive expression rate in the two groups was higher（92.5%for the study group and 85.0%for the control group），but there was no statistically significant difference between them（P＞0.05）.The EGFL7 high expression rate in the study group was higher than that in the control group，the difference was statistically significant（37.9% vs.10.0%，P＜0.05）；the EGFL7 expression in the study group had no correlation with the patients′gender，age and EB viral anti body（P＞0.05）；and had correlation with the high and low expression of EGFL7，lymph node metastasis and clinical stage（P＜0.05）. The Pearson correlation analysis found the positive correlation between EGFL7 expression and MVD value（r=0.700，P=0.000）. ConclusionEGFL7 is expressed in NPC cells，moreover is closely associated with the growth，invasion and metastasis of NPC，which may participate in the development of NPC by affecting the blood vessels generation and may become one of markers reflecting NPC metastasis and prognosis.

Nasopharyngeal neoplasms；Epidermal growth factor；Domains；Capillaries；Neoplasm metastasis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.007

A

1009-5519（2016）04-0497-03

趙燕戀（1980-），碩士研究生，主治醫師，主要從事鼻咽癌基礎與臨床研究。

（2015-11-21）