β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇逆轉運的影響及機制*

李秀英，葉　云（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科，四川瀘州646000）

·論著·

β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇逆轉運的影響及機制*

李秀英，葉云△（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科，四川瀘州646000）

目的探討β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇逆轉運的影響及相關機制。方法采用氧化低密度脂蛋白（oxLDL）誘導的RAW264.7巨噬細胞為泡沫細胞模型，給予β-葡聚糖進行干預。通過油紅O染色及酶比色法定量檢測細胞內總膽固醇和膽固醇酯水平的變化；采用Western blotting及實時定量PCR檢測β-葡聚糖對巨噬細胞ATP結合盒轉運蛋白A1（ABCA1）及其mRNA表達的影響并進行統(tǒng)計分析。同時采用蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理細胞4、8、12 h測定ABCA1穩(wěn)定性。結果與oxLDL處理組比較，β-葡聚糖對巨噬細胞攝取脂質的抑制率為 （90.0±1.8）%，oxLDL處理組巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇酯及總膽固醇與β-葡聚糖處理組 （2.5、5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖+oxLDL共同孵育）比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖處理組巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1及其mRNA表達與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或0.05）。β-葡聚糖（10.0 μg/mL）與CHX共同處理組在細胞孵育4、8、12 h時，ABCA1降低水平均小于CHX處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論β-葡聚糖通過增加ABCA1的表達水平及增強其穩(wěn)定性，促進細胞內膽固醇的排出，最終抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。

β葡聚糖類；巨噬細胞；膽固醇；泡沫細胞；膽固醇酯；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是冠狀動脈疾病的主要危險因素，是發(fā)達國家人群致死、致殘的首要病因，在發(fā)展中國家其發(fā)生率也逐漸呈增高趨勢［1］。脂質含量豐富的巨噬細胞源性泡沫細胞是動脈粥樣硬化損傷形成的標志，也是導致動脈粥樣硬化損傷的原因［2］。巨噬細胞泡沫化與巨噬細胞大量攝取氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、細胞內膽固醇排出障礙及細胞內大量蓄積膽固醇酯（CE）有關［3］。膽固醇逆轉錄受體ATP結合盒轉運蛋白 A1（ABCA1）負責將巨噬細胞內膽固醇排出［4］。有研究結果顯示，增加ABCA1的表達可以抑制泡沫細胞的形成，并最終延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［5-6］。

β-葡聚糖主要來源于新鮮的食品，如燕麥、啤酒酵母等。有研究顯示，β-葡聚糖具有降低血脂、抗氧化、預防動脈粥樣硬化的作用［7］，但具體機制尚不清楚。本研究擬從ABCA1表達變化的角度探討β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇排出的影響，為β-葡聚糖抗動脈粥樣硬化作用機制的研究和臨床應用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞RAW264.7巨噬細胞（美國ATCC細胞庫），由重慶醫(yī)科大學生命科學院提供。

1.1.2試劑油紅O（規(guī)格：5 g，批號：215-295-3）、甘油明膠（規(guī)格：100 mL，批號：G5516，純度：≥99%）、β-葡聚糖（規(guī)格：25 mg，批號：P1120100）均購自美國Sigma公司；ABCA1（ab18180）、β-actin（ab8226）抗體購于美國Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基（規(guī)格：500mL，批號：1740266）、胎牛血清（規(guī)格：200 mL，批號：150202）購自Gibco公司；oxLDL（規(guī)格：2 mg，批號：2015-12-22）購自廣州奕源生物公司。

1.1.3儀器H1650-W臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；ESCO垂直流超凈工作臺（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；BBD6220 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；IX71-A21PH倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；DHP-9402電熱恒溫培養(yǎng)箱［德創(chuàng)科儀（北京）科技有限公司］；Fluoroskan Ascent FL酶標儀（美國Thermo Forma公司）；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及凍存RAW264.7巨噬細胞復蘇后，使用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清置于含5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，當傳至第5代時可將細胞用于實驗。取對數(shù)生長期細胞，消化、離心、稀釋細胞至密度為2×106mL-1，分裝于凍存管中，置于-80℃冰箱中，過夜后轉至液氮罐保存。

1.2.2噻唑藍（MTT）法檢測細胞活性RAW264.7巨噬細胞接種于96孔板中，將細胞分成對照組及β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）干預組。每組3個復孔，待細胞生長良好后，β-葡聚糖干預組分別加入濃度為2.5、5.0、10.0 μg/mL的β-葡聚糖，培養(yǎng)24 h后，加入20 μL MTT孵育4 h，加入二甲亞砜（DMSO）120 μL，振蕩10 min，在波長570 nm處檢測吸光度A570nm。

1.2.3油紅O染色檢測細胞內脂質含量將RAW264.7巨噬細胞接種于6孔板內，分為對照組、oxLDL處理組（100 μg/mL oxLDL孵育24 h）、β-葡聚糖處理組（5.0 μg/mL β-葡聚糖及100 μg/mL oxLDL共同孵育24 h）。細胞孵育結束后，棄上清液，10%多聚甲醛固定30 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕洗1次后，油紅O染色10 min，再用60%異丙醇洗滌細胞1次（孵育時間10 s），棄異丙醇，PBS輕輕洗1次后顯微鏡下照相。

1.2.4細胞內總膽固醇（TC）及CE含量測定將RAW264.7巨噬細胞接種于 6孔板內，分為對照組、oxLDL處理組（100 μg/mL oxLDL孵育24 h）、β-葡聚糖處理組（2.5、5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖及100 μg/mL oxLDL共同孵育24 h），細胞孵育結束后，收集細胞，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，加入80 μL無水乙醇，超聲提取10 s后，10 000 r/min離心5 min，吸上清液至EP管中，按照試劑盒說明書分別測定細胞內TC及CE含量。

1.2.5Western blotting檢測ABCA1的表達及其蛋白穩(wěn)定性（1）ABCA1表達量的測定：將處于對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞分為對照組、β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）處理組，孵育24 h后，收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞并提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。25 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合后煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳100 V恒壓2 h，濕轉300 mA恒流1.5 h，5%脫脂奶粉封膜1 h，磷酸鹽緩沖液+0.1%吐溫-20（PBST）漂洗 3次后分別加入一抗和 β-actin 4℃孵育過夜，PBST漂洗3次，37℃二抗 （1∶1000稀釋）反應1 h后進行電化學發(fā)光（ECL）顯色。以β-actin作為內參，計算目的蛋白的表達量。（2）對于ABCA1穩(wěn)定性的測定：將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞分為對照組、蛋白合成抑制劑放線菌酮（CHX）處理組、10.0 μg/mL β-葡聚糖與2.0 μg/mL CHX共同處理組，孵育時間為4、8、12 h，收集孵育后的細胞，按照上述方法檢測ABCA1的變化。

1.2.6熒光定量PCR檢測ABCA1 mRNA表達將處于對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞分為對照組、β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）處理組，孵育 24 h后，用Trizol提取細胞RNA，經Takara逆轉錄試劑盒合成cDNA，再通過引物進行熒光定量PCR擴增。所用引物包括：β-actin上游：5′-TTGTCCCTGTATGCCTCTGG-3′；βactin下游：5′-TTGTCCCTGTATGCCTCTGG-3′；ABCA1上游：5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAATAGTTGT-3′，ABCA1下游：5′-CCCGGAAACGCAAGTCC-3′，實驗結果用β-actin的mRNA標準化。

1.3統(tǒng)計學處理應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用雙尾t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1不同質量濃度β-葡聚糖對RAW264.7巨噬細胞活性的影響β-葡聚糖質量濃度為2.5、5.0、10.0 μg/mL時，檢測所得A570nm值分別為3.68±0.06、3.68±0.06、3.69± 0.07，與對照組（3.65±0.05）比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2.5、5.0、10.0 μg/mL的β-葡聚糖對RAW264.7巨噬細胞的活性無影響，因此，在后續(xù)實驗中選取的β-葡聚糖質量濃度為2.5、5.0、10.0 μg/mL。

2.2不同質量濃度β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇含量的影響oxLDL處理組巨噬細胞源性泡沫細胞內CE及TC含量明顯增加，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；oxLDL+β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）處理組TC及CE含量與oxLDL處理組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　不同質量濃度β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇含量的影響（±s，mg/dL，n=3）

表1　不同質量濃度β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇含量的影響（±s，mg/dL，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與oxLDL處理組比較，bP＜0.05。

膽固醇對照組　o x L D L處理組o x L D L + 2 . 5 μ g / m L β-葡聚糖處理組o x L D L + 5 . 0 μ g / m L β-葡聚糖處理組o x L D L + 1 0 . 0 μ g / m L β-葡聚糖處理組T C C E 3 6 2 . 0 ± 1 9 . 0 2 1 6 . 0 ± 1 2 . 0 6 5 1 . 6 ± 2 0 . 0a3 2 4 . 0 ± 1 5 . 0a3 9 8 . 2 ± 2 8 . 0b2 5 9 . 2 ± 2 0 . 0b3 2 5 . 8 ± 2 5 . 0b2 4 1 . 9 ± 2 8 . 0b2 8 9 . 6 ± 3 0 . 0b1 9 4 . 4 ± 1 7 . 0b

2.3β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響

對照組細胞內聚集的脂質較少，oxLDL處理組細胞內脂質明顯增多，油紅O染色后陽性細胞數(shù)為對照組的（5.00± 0.07）倍，與oxLDL處理組比較，5.0 μg/mL β-葡聚糖處理細胞后，細胞內脂質聚集減少，油紅O染色后陽性細胞減少（90.0±1.8）%。見圖1。

圖1　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響（油紅O染色，400×）

2.4β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1及其mRNA表達的影響2.5、5.0、10.0 μg/mLβ-葡聚糖處理組ABCA1表達顯著高于對照組，5.0、10.0μg/mLβ-葡聚糖處理組ABCA1 mRNA表達顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或0.05），見表2、3，圖2。

表2　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達的影響（±s，n=3）

表2　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別對照組β-葡聚糖處理組（μ g / m L ）2 . 5 5 . 0 1 0 . 0 A B C A 1 / β -a c t i n 1 . 5 0 ± 0 . 0 5 1 . 8 0 ± 0 . 0 6a1 . 9 5 ± 0 . 0 8a2 . 2 5 ± 0 . 0 4a

表3　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1 mRNA表達的影響（±s，n=3）

表3　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1 mRNA表達的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別對照組β-葡聚糖處理組（μ g / m L ）2 . 5 5 . 0 1 0 . 0 A B C A 1 m R N A 1 . 7 0 ± 0 . 0 6 1 . 8 7 ± 0 . 0 5 1 . 9 5 ± 0 . 0 7a2 . 1 0 ± 0 . 0 8a

圖2　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達的影響

2.5β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞 ABCA1穩(wěn)定性的影響β-葡聚糖（10.0 μg/mL）與CHX共同處理組在細胞孵育4、8、12 h時，ABCA1降低水平均小于CHX處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4、圖3。

表4　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1穩(wěn)定性的影響（±s，n=3）

表4　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1穩(wěn)定性的影響（±s，n=3）

注：與CHX處理組相同時間點比較，aP＜0.05。

組別　0 h　4 h　8 h　1 2 h C H X處理組C H X + β-葡聚糖處理組1 . 3 0 ± 0 . 0 4 1 . 3 0 ± 0 . 0 4 0 . 3 9 ± 0 . 0 3 0 . 6 5 ± 0 . 0 5a0 . 2 6 ± 0 . 0 6 0 . 5 2 ± 0 . 0 3a0 . 2 4 ± 0 . 0 2 0 . 3 0 ± 0 . 0 3a

圖3　β-葡聚糖對巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1穩(wěn)定性的影響

3　討　論

已有研究表明，β-葡聚糖有降血脂、預防動脈粥樣硬化的作用［7］。但β-葡聚糖是否減少巨噬細胞內CE的聚集及相關機制鮮見報道。本研究結果顯示，β-葡聚糖通過促進巨噬細胞膽固醇逆轉運受體ABCA1的表達及增強ABCA1蛋白穩(wěn)定性，減少巨噬細胞內CE的聚集，抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。

膽固醇逆轉運受體介導的巨噬細胞內膽固醇的排出在維持巨噬細胞膽固醇處于平衡狀態(tài)過程中起著重要作用［4］。本研究結果證明了β-葡聚糖通過減少巨噬細胞內CE及TC含量，抑制巨噬細胞對oxLDL的攝取，從而抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。此外，β-葡聚糖顯著增加巨噬細胞ABCA1及其mRNA的表達。量化β-葡聚糖對ABCA1變化的影響發(fā)現(xiàn)，10.0 μg/mL β-葡聚糖增加ABCA1的表達量（50%，2.25/1.50）大約為β-葡聚糖介導的ABCA1 mRNA升高量（24%，2.10/1.70）及β-葡聚糖穩(wěn)定ABCA1表達量（25%，0.30/0.24）的總和，該結果表明β-葡聚糖是通過調控ABCA1逆轉錄水平及轉錄后水平增加ABCA1的表達。ABCA1是巨噬細胞排出膽固醇的主要膽固醇逆轉運受體［4］。此外，ABCA1在維持巨噬細胞內膽固醇平衡的重要作用已經得到公認［8-9］。由ABCA1的功能可知，β-葡聚糖增加ABCA1表達的作用與β-葡聚糖減少巨噬細胞內CE及TC含量，最終抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成有關。

綜上所述。本研究提供了β-葡聚糖抗動脈粥樣硬化的新機制，同時也為抗動脈粥樣硬化提供了治療靶點。

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Effects of β-glucan on reverse cholesterol transport of macrophage-derived foam cells and its mechanism*

Li Xiuying，Ye Yun△（Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo explore the effects of β-glucan on the reverse cholesterol transport of macrophage-derived foam cells and its relative mechanism.MethodsOxidized low-density lipoprotein（oxLDL）induced RAW264.7 macrophages were adopted as the foam cells model for giving the β-glucan intervention.The Oil-red O staining and enzymatic colorimetry were employed to examine the changes of intracellular total cholesterol and cholesteryl ester；Western blotting and real-time PCR were used to detect the effect of β-glucan on the expression on ATP-binding cassette transporter protein A1（ABCA1）and mRNA in macrophages.The obtained data were statistically analyzed.The protein synthesis inhibitors cycloheximide（CHX）processed cell 4，8，12 h，thus，deter minated ABCA1 stability.ResultsThe inhibiting rate of β-glucan on macrophage′lipid uptake was（90.0± 1.8）%，total cholesterol and cholesteryl ester levels had statistical difference between the oxLDL group and the co-incubation groups of oxLDL and 5.0，10.0 μg/mL β-glucan（P＜0.05）；the expression of ABCA1 and mRNA had statistical differences between the 5.0，10.0 μg/mL β-glucan groups and the control group（P＜0.01 or 0.05）.β-glucan（10.0 μg/mL）and CHX common treatment group in cell incubation 4，8，12 h，ABCA1 lower level less than CHX treatment group，the difference was statistically significant （P＜0.05）.Conclusionβ-glucan promotes the intracellular cholesterol discharge and finally inhibits the formation of macrophagederived foam cells by enhancing ABCA1 expression and protein stability.

Beta-glucans；Macrophages；Cholesterol；Foam cells；Cholesterol esters；Atherosclerosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.14.001

A

1009-5519（2016）14-2117-03

國家青年自然科學基金項目（81500357）；西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院課題項目（15044）；西南醫(yī)科大學課題項目（2015-03-10）。

李秀英（1987-），博士研究生，主管藥師，主要從事動脈粥樣硬化發(fā)病機制研究。

△，E-mail：yeyun8622@163.com。

（2016-04-07）