不同提取溶劑對(duì)銀杏葉藥材中多種成分含量的影響

王兆華，紀(jì)義波，張大軍

(1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.吉林省醫(yī)療器械研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062)

不同提取溶劑對(duì)銀杏葉藥材中多種成分含量的影響

王兆華1，紀(jì)義波2，張大軍1

(1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.吉林省醫(yī)療器械研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062)

目的 ：研究水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇五種提取溶劑對(duì)銀杏葉藥材中總黃酮醇苷、萜類內(nèi)脂及總銀杏酸含量的影響，為銀杏葉的合理使用提供依據(jù)。方法： HPLC條件：總黃酮醇苷檢測(cè)采用Shim-pack C18色譜柱 (150mm×4.6mm，5μm)，甲醇 - 0.4%磷酸溶液(50:50)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm；萜類內(nèi)脂檢測(cè)采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，甲醇-四氫呋喃-水(25:10:65)為流動(dòng)相，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度105℃，載氣流速2.8L/min；總銀杏酸檢測(cè)采用Shim-pack C18色譜柱 (150mm×4.6mm，5μm)，甲醇 - 1%冰醋酸溶液(90:10)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm。結(jié)果： 槲皮素、山奈素、異鼠李素分別在0.0576～0.576μg、0.05672～0.5672μg、0.04128～0.4128μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系；銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯分別在 2.442 ～ 20.35μg、 2.109 ～17.575μg 、1.803 ～ 15.025μg、1.992 ～ 16.60μg 范圍內(nèi)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)與峰面積的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系；白果新酸在0.2008～2.008μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系；水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇回流提取制備的供試品溶液中總黃酮醇苷的含量分別為2.06，2.85，3.20，3.50，2.97 mg/20mL；萜類內(nèi)脂的含量分別為0，1.04，1.25，1.57，2.08 mg/20mL；總銀杏酸的含量分別為0，7.95，10.20，11.61，12.13 mg /20mL。結(jié)論： 不同提取溶劑制備的供試品溶液中三種成分的含量差別很大，民間以泡茶的方式服用銀杏葉是合理的，切不可泡酒服用。

銀杏葉；總黃酮醇苷；萜類內(nèi)脂；總銀杏酸；高效液相色譜

銀杏樹(shù)(Ginkgo biloba L.)[1]又名白果樹(shù)，被譽(yù)為地球的"長(zhǎng)壽樹(shù)。其葉、果實(shí)、種子均有較高的藥用價(jià)值，銀杏葉中的黃酮類及萜類內(nèi)酯化合物為有效成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏葉提取物具有抗血小板活化因子、抗腦缺血、降血脂、抗氧化、改善心腦血管循環(huán)等多種作用，是預(yù)防治療老年癡呆的理想飲品[2]，民間多以其泡茶或泡酒飲用。銀杏葉的銀杏酚酸，卻是引起臨床不良反應(yīng)的主要物質(zhì)，因此銀杏酸的限量是評(píng)價(jià)銀杏葉制劑質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一[3]。為能給銀杏葉的合理使用提供依據(jù)，故對(duì)不同提取溶劑對(duì)銀杏葉藥材中總黃酮醇苷、萜類內(nèi)脂及總銀杏酸[4]含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

LC-20AB高效液相色譜儀(日本島津公司)；Alltech Grace ELSD 3300檢測(cè)器；LC - 10 AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD- 10A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；KQ-250型超聲波處理器(天津奧特賽恩斯儀器公司)，AE163電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥

槲皮素(批號(hào)100081-200406，供含量測(cè)定用)、山奈素(批號(hào)110861-200808，供含量測(cè)定用)、異鼠李素(批號(hào)110860-200406，供含量測(cè)定用)；銀杏內(nèi)酯 A(批號(hào)110862-200608，供含量測(cè)定用)、銀杏內(nèi)酯 B(批號(hào)110863-200508，供含量測(cè)定用)、銀杏內(nèi)酯 C(批號(hào)110864-200906，供含量測(cè)定用)，白果內(nèi)酯(批號(hào)110865-200606，供含量測(cè)定用)；白果新酸(批號(hào)111690-200702，供含量測(cè)定用)，總銀杏酸(111594-201304，供限量檢查定位)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；銀杏葉藥材購(gòu)自江蘇徐州，經(jīng)本院生藥室鑒定為Ginkgo biloba L.的干燥葉；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；四氫呋喃、乙酸、磷酸、石油醚等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液制備

取銀杏葉藥材50g，多份，分別加水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇500mL，提取2次，每次1小時(shí)，合并提取液，濾過(guò)，濾液定容至1000mL，即得樣品溶液。

2.2 總黃酮醇苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack C18(150mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相：甲醇 - 0.4%磷酸溶液(50:50)；流速：1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取槲皮素對(duì)照品、山奈素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL各含28.80μg、28.36μg、20.64μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備與測(cè)定

取2.1項(xiàng)下的5個(gè)樣品溶液各10mL，分別以甲醇稀釋并定容至25mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別吸取供試品溶液及2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各10μL，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總黃酮醇苷含量。不同提取溶劑中總黃酮醇苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，液相色譜圖見(jiàn)圖1。

A-黃酮醇苷對(duì)照品；B-銀杏葉；C-萜類內(nèi)脂對(duì)照品；D-銀杏葉；E-白果新酸對(duì)照品；F-總銀杏酸對(duì)照品；G-銀杏葉；1-槲皮素；2-山奈素；3-異鼠李素；4-白果內(nèi)酯；5-銀杏內(nèi)酯C；6-銀杏內(nèi)酯A；7-銀杏內(nèi)酯B；8-白果新酸；9.10.11-總銀杏酸

圖1 HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2，4，8，12，16，20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值。以進(jìn)樣量(C)為縱坐標(biāo)，以峰面積積分值(A)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。分別得回歸方程為：槲皮素：Y=1705815.194X+2063.504(r=0.9991)；山奈素：Y=1930920.7X-3040.110(r=0.9996)；異鼠李素：Y=1893976.496X+ 5732.49(r=0.9997)。結(jié)果表明槲皮素、山奈素和異鼠李素分別在0.0576～0.576μg，0.05672～0.5672μg，0.04128～0.4128μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，槲皮素峰面積RSD=0.85%，山奈素峰面積RSD=0.95%，異鼠李素峰面積RSD=0.98%，表明儀器精密度良好。

2.3 萜類內(nèi)酯含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-四氫呋喃-水(25:10:65)；流速：1mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度105℃，載氣流速2.8L/min。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取銀杏內(nèi)酯A對(duì)照品、銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品、銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品、白果內(nèi)酯對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1mL各含0.814mg、0.704mg、0.601mg、0.664mg的混合溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備與測(cè)定

取2.1項(xiàng)下的5個(gè)樣品溶液各30mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，靜置后，精密量取上清液5mL，加入酸性氧化鋁柱(200～300目，3g，內(nèi)徑為1cm)上，用甲醇25mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。吸取供試品溶液20μL，2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液5μL、10μL，按2.3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算萜類內(nèi)酯含量。不同提取溶劑中萜類內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.3.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液3，5，10，15，20，25μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。分別得到回歸方程: 銀杏內(nèi)酯A：logY =0.8610 log X + 6.282 (r = 0. 999 4)；銀杏內(nèi)酯B：logY =0.9049 log X+5.9501 (r =0. 999 4)；銀杏內(nèi)酯B：logY = 0.8053 logX+6.5398 (r =0. 999 3)；白果內(nèi)酯：log Y =1.0866 logX +5.8960 (r =0. 999 7)；結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯分別在 2.442 ～ 20.35μg、2.109 ～17.575μg 、1.803 ～ 15.025μg、1.992 ～ 16.60μg 范圍內(nèi)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)與峰面積的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液5μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯峰面積對(duì)數(shù)的RSD 分別為 1.08%、 1.97%、 1.46%、1.19%，表明儀器精密度良好。

2.4 總銀杏酸含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack C18(150mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相：甲醇 - 1%冰醋酸溶液(90:10)；流速：1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：310nm。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取白果新酸對(duì)照品、總銀杏酸對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1m含0. 1004 mg、0. 115mg 的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備與測(cè)定

量取2.1項(xiàng)下的5個(gè)樣品溶液各10mL，濃縮約3mL，加硅膠5g，裝柱，以石油醚(60～90℃)40mL洗脫，棄去洗脫液，再以石油醚(60～90℃)-乙醚-甲酸混合液(89：11：1)40mL洗脫，收集洗脫液，低溫濃縮至近干，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?5mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液及2.4.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各10μL，按2.4.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以銀杏總酸定位，以白果新酸為對(duì)照計(jì)算總銀杏酸含量。不同提取溶劑中總黃酮總銀杏酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4.4 線性關(guān)系考察

精密吸取白果新酸對(duì)照品溶液 2，4，8，12，16，20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以進(jìn)樣量(C)為縱坐標(biāo)，以峰面積積分值(A)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為：Y=188536.164X + 1309.757(r=0.9995)，結(jié)果表明白果新酸在0.2008～2.008μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn)

吸取2.4.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD=0.96%，表明儀器精密度良好。

3 結(jié)論(1)通過(guò)對(duì)銀杏葉五種不同溶劑提取物中總黃酮醇苷、萜類內(nèi)脂及總銀杏酸含量測(cè)定可見(jiàn)：總黃酮醇苷含量從高到底的順序?yàn)?0%乙醇提取物 > 50%乙醇提取物 > 70%乙醇提取物 > 40%乙醇提取物>水提取物；萜類內(nèi)脂含量從高到底的順序?yàn)?0%乙醇提取物 >60%乙醇提取物 > 50%乙醇提取物 > 40%乙醇提取物，水提取物中未檢出萜類內(nèi)脂成分；總銀杏酸含量的順序與萜類內(nèi)脂含量順序一致。為使銀杏葉中有效成分黃酮類及萜類內(nèi)酯成分浸出充分，宜采用60%乙醇提取，但60%乙醇提取液中，毒性成分銀杏酚酸含量較高，可高達(dá)11.61mg/20mL，遠(yuǎn)高于百萬(wàn)分之十的限度規(guī)定，故提醒百姓為了健康，切不可將銀杏葉泡酒飲用。

(2)將水煎煮提取液的取樣量增大5倍，亦未檢出銀杏酸。

(3)在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用大孔樹(shù)脂處理銀杏葉提取液，不但可以富集總黃酮醇苷、萜類內(nèi)脂成分，更可以除去總銀杏酸。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典2010版[M].一部. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：296.

[2] 丁 東，張展鵬，權(quán)美平. 銀杏葉提取物的化學(xué)成分、生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].江蘇調(diào)味副食品，2015(3)：5-8.

[3] 王蕎薇，謝媛媛，王義明，等.銀杏葉中銀杏酚酸類成分含量測(cè)定方法研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50(3)：167-173.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典2010版[M].一部. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：392.

(本文文獻(xiàn)格式：王兆華，紀(jì)義波，張大軍.不同提取溶劑對(duì)銀杏葉藥材中多種成分含量的影響[J].山東化工，2016，45(02)：22-24，27.)

Effect of Different Kinds of Solvent in the Contents of Various Components from Ginkgo Leaves

Wang Zhaohua1, Ji Yibo2, Zhang Dajun1

(1. Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012,China;2.Jilin Medical Device Testing Institute, Changchun 130062, China)

Objective To research the effects of water, 40% ethanol, 50% ethanol, 60% ethanol, 70% ethanol on the content of total flavonol glycosides, terpene lactones and total ginkgolic acid in ginkgo leaves，for providing the basis for the reasonable use of the ginkgo leaves. Method Condition of HPLC: the way to test content of total flavonol glycosides was using Shim-pack C18column (150mm×4.6mm，5μm) with methanol -0. 4% phosphoric acid 50∶50, V/V))as mobile phase , the detective wavelength was set at 360 nm. The way to test content of terpene lactones was using Agilent ZORBAX SB-C18 column (250mm×4.6mm,5μm) with methanol-tetrahydrofuran-water (25:10:65, V/V) as the mobile phase, where the drift tube temperature of the evaporative light scattering detector was 105℃ and the flowing rate of carrier gas of it was 2.8L/min. The way to test content of total ginkgolic acid was using Shim-pack C18column (150mm×4.6mm，5μm) with methanol - 1% glacial acetic acid (90:10, V/V)) as the mobile phase, the detective wavelength was set at 310 nm. Result: Quercetin 、kaempferol 、isorhamnetin was linear in the range of 0.0576 ～ 0.576μg、 0.05672 ～ 0.5672μg 、0.04128 ～ 0.4128 g；Ginkgolide A 、ginkgolide B 、ginkgolide C、bilobalide was linear in the range of 2.442～20.35μg、 2.109～17.575μg 、1.803～15.025μg、1.992～16.60μg ；ginkgolic acid was linear in the range of 0.2008 ～2.008μg..The contents of total flavonol glucosides in the extracts prepared from water,40% ethanol, 50% ethanol, 60% ethanol, 70% ethanol refluxing were 2.06, 2.85, 3.20, 3.50, 2.97 mg/20mL. The contents of terpene lactones were 0, 1.04, 1.25, 1.57, 2.08 mg/20mL. The contents of total ginkgolic acid were 0, 7.95, 10.20, 11.61, 12.13 μg/20mL. Conclusion The contents of three components in the solution of different solvents were different. The folk way of taking ginkgo leaves as tea is reasonable, but to take it with wine is prohibited.

ginkgo leaves； total flavonol glycosides； terpene lactones；total ginkgolic acid；HPLC

2015-12-06

吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(20132090)

王兆華(1965—),女，主任藥師.研究方向：中藥新藥與新制劑。

TQ464

A

1008-021X(2016)02-0022-03