歐典螺旋霉素發(fā)酵工藝以及組分的優(yōu)化研究

劉迎賓，徐 虹，萬 丹，張明明，楊思聰，孫春玲

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2.天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

歐典螺旋霉素發(fā)酵工藝以及組分的優(yōu)化研究

劉迎賓1，2，徐 虹1，萬 丹1，2，張明明1，2，楊思聰2，孫春玲2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2.天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

首先在培養(yǎng)基中加入不同的金屬離子減少歐典螺旋霉素中的各雜質(zhì)，鈷離子對(duì)雜質(zhì)組成成分的影響最為顯著，實(shí)驗(yàn)證明所選金屬離子都會(huì)不同程度地減少不同的雜質(zhì)，因此培養(yǎng)基中的加入所選金屬離子對(duì)于組分優(yōu)化效果較好。由于加入甲基化試劑氯化膽堿能夠使雜質(zhì)A甲基化為主產(chǎn)物，因此培養(yǎng)基中加入0.8g/mL的氯化膽堿為較優(yōu)培養(yǎng)條件。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)時(shí)間為48h時(shí)，種子液為活力最佳狀態(tài)。因此，培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時(shí)間都得到了優(yōu)化。

歐典螺旋霉素；發(fā)酵；組分

螺旋霉素(Spiramycin，簡稱SPM)是一種16元大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素，具有提高體內(nèi)吞噬細(xì)胞功能的作用，有較強(qiáng)的體內(nèi)抗菌作用以及持續(xù)的抗生素后效性，而且不良反應(yīng)比紅霉素明顯要低。臨床使用已經(jīng)有三十多年了，并且在治療弓形蟲等方面具有廣泛的發(fā)展前景。

螺旋霉素的作用機(jī)理在于其內(nèi)酯環(huán)，能夠針對(duì)核糖體的50s亞基，通過阻斷轉(zhuǎn)移肽和m-RNA的轉(zhuǎn)移進(jìn)程繼而阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。依據(jù)16環(huán)上第三位碳原子上的酞化程度，螺旋霉素有三種有效組分，螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)未被酞化，螺旋霉素Ⅱ(SPMⅡ)，螺旋霉素Ⅲ(SPMⅢ)，后兩者分別被乙酰化和丙酰化[1]。螺旋霉素的分子式如圖1，它們的抗菌和抗支原體活性又隨著在4"一位上酰基碳原子數(shù)目的增加而增大,即從乙酰基、丙酰基、丁酰基到異戊酰基。

圖1 螺旋霉素分子式

國外生產(chǎn)的螺旋霉素主要組分為SPMI,各組分含量分別為Ⅰ:43%～91%,Ⅱ:2%～25%,Ⅲ:7～4既,國內(nèi)生產(chǎn)螺旋霉素主要為組分m,組分含量分別為Ⅰ:6%～12%,Ⅱ:27%～39%,Ⅲ:52%～66%[2]。天方藥業(yè)于1999年開發(fā)了國外螺旋霉素品種，因質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)歐洲藥典，故命名為歐典螺旋霉素。但是在雜質(zhì)含量，主產(chǎn)物的純化以及菌種的發(fā)酵培養(yǎng)條件上還需要做進(jìn)一步的研究。

本人就歐典螺旋霉素的組分優(yōu)化和生產(chǎn)工藝做了如下的研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 菌種

生二素鏈霉菌(Strepomyces spiramyceticus)。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面孢子培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%、黃豆餅粉3%、硫酸鎂0.5%、碳酸鈣1%、瓊脂粉1%，pH值為6.4～6.7

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%、黃豆餅粉1%、固體玉米糊0.5%、氯化鈉1%、蛋白胨0.5%，pH值為6.4～6.7。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%、黃豆餅粉1%、玉米糊2.0%、氯化鈉0.5%、豆油1%，pH值6.4～6.7。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

一級(jí)培養(yǎng)：于斜面27℃，培養(yǎng)時(shí)間16～18d，種子27℃培養(yǎng)48h，裝量30mL于250mL錐形瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，偏心距為50mm。

二級(jí)培養(yǎng)： 裝量25mL于250mL錐形瓶中， 27℃培養(yǎng)6d，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，偏心距為50mm。測(cè)效價(jià)。

1.2.2 螺旋霉素發(fā)酵液效價(jià)的測(cè)定方法

SPM生物效價(jià)測(cè)定法：管碟法[3]。

原理:利用抗菌素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散滲透作用,將已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)溶液與未知效價(jià)的樣品溶液,在同樣的條件下,在攤布有高度敏感性的試驗(yàn)菌培養(yǎng)基上,進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后,在抗菌素到達(dá)的適當(dāng)濃度范圍內(nèi),產(chǎn)生了透明的抑菌圈,比較二者抑菌圈的大小,利用圖表法推算出未知抗菌素的效價(jià)

2 結(jié)果與討論

2.1 不同金屬離子對(duì)歐典螺旋霉素組分的影響

微量金屬離子對(duì)于微生物的生長有著極為重要的影響，如鈷離子位于大腸桿菌蛋氨酸氨基膚酶、緩癥鏈球菌的氨基膚酶以及乳桿菌屬的二膚酶的活性中心位置，為微生物生長所必須的微量元素。低濃度的金屬離子是微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，而濃度過高時(shí)則會(huì)抑制微生物的生長，甚至造成毒害。

而研究表明，已知?dú)W典螺旋霉素中有四種不同且難以分離的雜質(zhì)，而不同的金屬離子對(duì)歐典螺旋霉素雜質(zhì)有不同的影響。本人在培養(yǎng)基中加入不同金屬離子[4]，篩選出對(duì)主要雜質(zhì)影響最為顯著的金屬離子，減少雜質(zhì)，優(yōu)化歐典螺旋霉素的發(fā)酵組分。

將各種金屬離子分別加入到培養(yǎng)基中，以測(cè)定SPM效價(jià)的方法進(jìn)行最終效果的鑒別，見表1。

表1 培養(yǎng)基中加入不同金屬離子的實(shí)驗(yàn)序號(hào)

根據(jù)SPM評(píng)價(jià)效價(jià)結(jié)果如下表2 。

表2 加入各金屬離子的發(fā)酵組分及其產(chǎn)量

從表可以看出，各個(gè)金屬離子對(duì)于歐典螺旋霉素主產(chǎn)物、雜質(zhì)效價(jià)均有影響，SPM的含量和雜質(zhì)的總量呈一種平衡關(guān)系。硫酸銨和硝酸銨和氯化鉀對(duì)雜質(zhì)C的影響較大，氯化鉀、硫酸鋅以及氯化鈷對(duì)雜質(zhì)A和D的影響較大，以氯化鈷的影響最為顯著，且氯化鈷對(duì)雜質(zhì)C的影響也很大，其次為硝酸銨。

2.2 生產(chǎn)發(fā)酵工藝的優(yōu)化

歐典螺旋霉素的產(chǎn)量以及純度都與種子液有著密不可分的關(guān)系，而種子液的質(zhì)量又取決于培養(yǎng)基組成成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間以及接種量等因素。

表3 培養(yǎng)基不同成分的實(shí)驗(yàn)序號(hào)

結(jié)合以上根據(jù)金屬離子對(duì)歐典螺旋霉素雜質(zhì)的組成成分以及比例都有顯著的影響，因此把硫酸銨、硝酸銨、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鈷都加入培養(yǎng)基中，加入其它可能影響種子液生長情況以及SPM含量的試劑，改變培養(yǎng)時(shí)間，觀察菌種濃度以及生長情況，選擇生長情況良好檢測(cè)效價(jià)。

另外，在檢測(cè)雜質(zhì)的過程中，我們發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)A的結(jié)構(gòu)只比主產(chǎn)物SPM1缺少一個(gè)甲基，因此，嘗試加入甲基化試劑，檢測(cè)是否能加強(qiáng)甲基化作用，減少雜質(zhì)含量，增加主產(chǎn)物SPM1比例。

2.2.1 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

原有的培養(yǎng)基成分營養(yǎng)不夠豐富，氮源、碳源成分易耗盡，影響菌體的繁殖，而且也不利于產(chǎn)物的積累。因此增加碳源和氮源的比例，調(diào)整種子培養(yǎng)基的碳氮比。優(yōu)化方案斜面孢子培養(yǎng)基不變，種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基中在加入金屬離子的基礎(chǔ)上添加更多的碳源和氮源。

進(jìn)行48h，37℃的培養(yǎng)。結(jié)果如下表4。

表4 不同培養(yǎng)基菌體生長情況以及效價(jià)評(píng)定

從結(jié)果來看，原種子培養(yǎng)基玉米糊改成1%+金屬離子的培養(yǎng)基對(duì)于種子液的生長情況以及主產(chǎn)物SPM1的產(chǎn)量和螺旋霉素的效價(jià)，相比而言都是更為合適的，以下培養(yǎng)時(shí)均用此培養(yǎng)基。

2.2.2 甲基化試劑的影響

選取三種甲基化試劑：葉酸、氯化膽堿以及甜菜堿。根據(jù)參考文獻(xiàn)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.8g/mL的甲基化試劑[5]。

表5 加入不同甲基化試劑后雜質(zhì)情況和效價(jià)評(píng)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表5初步證明，葉酸和甜菜堿對(duì)于減少雜質(zhì)成分，提高主產(chǎn)物的含量沒有太大的效果，氯化膽堿對(duì)螺旋霉素的生物合成有明顯的促進(jìn)作用。

2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間

種子液的培養(yǎng)時(shí)間與發(fā)酵的效果有著密切的關(guān)系，選取種子液在菌的對(duì)數(shù)生長期時(shí)，生長繁殖都較活躍，能迅速適應(yīng)發(fā)酵罐中的生長環(huán)境，獲得最大程度的產(chǎn)量。若是菌種生長已經(jīng)處于斷枝狀態(tài)，即為已經(jīng)開始老化，不宜進(jìn)入發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)。本人選取了24h，48h，60h，72h的培養(yǎng)種子液，進(jìn)行分析比對(duì)。結(jié)果如下表6。

表6 不同培養(yǎng)時(shí)間及其菌絲生長情況

結(jié)果可以看出，培養(yǎng)時(shí)間為48h時(shí)最為合適，能獲得生長旺盛，質(zhì)量較好的菌體。

3 討論

通過以上實(shí)驗(yàn)，通過改變培養(yǎng)基的成分實(shí)現(xiàn)了歐典螺旋霉素的組分優(yōu)化，得到了雜質(zhì)相對(duì)較少主產(chǎn)物SPMⅠ能夠達(dá)到80%的螺旋霉素。但是這只是一個(gè)初步的條件選擇，比如金屬離子對(duì)雜質(zhì)的改變?nèi)匀恍枰M(jìn)一步的探討研究，還可以從菌種選育入手，優(yōu)化菌種，獲得較優(yōu)的突變菌種。期望較優(yōu)菌種結(jié)合較優(yōu)生產(chǎn)條件能在工業(yè)上擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得較好的醫(yī)學(xué)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

[1] 朱 峰,王爾健.螺旋霉素的再評(píng)價(jià)[J].中國抗生素雜志,1991,16(3):231-236.

[2] Anne BrissonNo?l , Patrick TrieuCuot , Patrice Courvalin .Mechanism of action of spiramycin and other macrolides[J].J Antimicrob Chemother ,1998,22(Suppl B)：13-23.

[3] Webster Carol, Ghazanfar Katayoun, Slack Richard. Subinhibitory and post-antibiotic effects of spiramycin and erythromycin on Staphylococcus aureus[J].J Antimicrob Chemother ,1988,22(Supple B): 33-39.

[4] 李友元，陳長華, 顧熠峰,等，基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)解析和降低螺旋霉素發(fā)酵雜質(zhì)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2005,21(2):275-278.

[5] 葉蕊芳, 史婷婷 ,張 燕,等，維生素螺旋霉素發(fā)酵的影響[J].化學(xué)與生物工程，2008,25(10):64-67.

(本文文獻(xiàn)格式：劉迎賓，徐 虹，萬 丹.歐典螺旋霉素發(fā)酵工藝以及組分的優(yōu)化研究[J].山東化工，2016，45(02)：25-27.)

2015-12-07

劉迎賓(1981—)，河南駐馬店人，學(xué)士學(xué)位，工程師，主要從事抗生素發(fā)酵的研究；通訊作者：徐 虹，西北農(nóng)林科技大學(xué)。

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