歐典螺旋霉素發酵工藝以及組分的優化研究

劉迎賓，徐 虹，萬 丹，張明明，楊思聰，孫春玲

(1.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；2.天方藥業有限公司，河南 駐馬店 463000)

歐典螺旋霉素發酵工藝以及組分的優化研究

劉迎賓1，2，徐 虹1，萬 丹1，2，張明明1，2，楊思聰2，孫春玲2

(1.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；2.天方藥業有限公司，河南 駐馬店 463000)

首先在培養基中加入不同的金屬離子減少歐典螺旋霉素中的各雜質，鈷離子對雜質組成成分的影響最為顯著，實驗證明所選金屬離子都會不同程度地減少不同的雜質，因此培養基中的加入所選金屬離子對于組分優化效果較好。由于加入甲基化試劑氯化膽堿能夠使雜質A甲基化為主產物，因此培養基中加入0.8g/mL的氯化膽堿為較優培養條件。同時，實驗證明培養時間為48h時，種子液為活力最佳狀態。因此，培養基成分和培養時間都得到了優化。

歐典螺旋霉素；發酵；組分

螺旋霉素(Spiramycin，簡稱SPM)是一種16元大環內酯類的抗生素，具有提高體內吞噬細胞功能的作用，有較強的體內抗菌作用以及持續的抗生素后效性，而且不良反應比紅霉素明顯要低。臨床使用已經有三十多年了，并且在治療弓形蟲等方面具有廣泛的發展前景。

螺旋霉素的作用機理在于其內酯環，能夠針對核糖體的50s亞基，通過阻斷轉移肽和m-RNA的轉移進程繼而阻斷細菌蛋白質的合成。依據16環上第三位碳原子上的酞化程度，螺旋霉素有三種有效組分，螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)未被酞化，螺旋霉素Ⅱ(SPMⅡ)，螺旋霉素Ⅲ(SPMⅢ)，后兩者分別被乙酰化和丙酰化[1]。螺旋霉素的分子式如圖1，它們的抗菌和抗支原體活性又隨著在4"一位上酰基碳原子數目的增加而增大,即從乙酰基、丙酰基、丁酰基到異戊酰基。

圖1 螺旋霉素分子式

國外生產的螺旋霉素主要組分為SPMI,各組分含量分別為Ⅰ:43%～91%,Ⅱ:2%～25%,Ⅲ:7～4既,國內生產螺旋霉素主要為組分m,組分含量分別為Ⅰ:6%～12%,Ⅱ:27%～39%,Ⅲ:52%～66%[2]。天方藥業于1999年開發了國外螺旋霉素品種，因質量標準依據歐洲藥典，故命名為歐典螺旋霉素。但是在雜質含量，主產物的純化以及菌種的發酵培養條件上還需要做進一步的研究。

本人就歐典螺旋霉素的組分優化和生產工藝做了如下的研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 菌種

生二素鏈霉菌(Strepomyces spiramyceticus)。

1.1.2 培養基

斜面孢子培養基：可溶性淀粉1%、黃豆餅粉3%、硫酸鎂0.5%、碳酸鈣1%、瓊脂粉1%，pH值為6.4～6.7

種子培養基：可溶性淀粉1%、黃豆餅粉1%、固體玉米糊0.5%、氯化鈉1%、蛋白胨0.5%，pH值為6.4～6.7。

發酵培養基：可溶性淀粉1%、黃豆餅粉1%、玉米糊2.0%、氯化鈉0.5%、豆油1%，pH值6.4～6.7。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

一級培養：于斜面27℃，培養時間16～18d，種子27℃培養48h，裝量30mL于250mL錐形瓶中，搖床轉速為220r/min，偏心距為50mm。

二級培養： 裝量25mL于250mL錐形瓶中， 27℃培養6d，搖床轉速為220r/min，偏心距為50mm。測效價。

1.2.2 螺旋霉素發酵液效價的測定方法

SPM生物效價測定法：管碟法[3]。

原理:利用抗菌素在瓊脂培養基內的擴散滲透作用,將已知效價的標準溶液與未知效價的樣品溶液,在同樣的條件下,在攤布有高度敏感性的試驗菌培養基上,進行對照培養。培養一定時間后,在抗菌素到達的適當濃度范圍內,產生了透明的抑菌圈,比較二者抑菌圈的大小,利用圖表法推算出未知抗菌素的效價

2 結果與討論

2.1 不同金屬離子對歐典螺旋霉素組分的影響

微量金屬離子對于微生物的生長有著極為重要的影響，如鈷離子位于大腸桿菌蛋氨酸氨基膚酶、緩癥鏈球菌的氨基膚酶以及乳桿菌屬的二膚酶的活性中心位置，為微生物生長所必須的微量元素。低濃度的金屬離子是微生物的營養物質，而濃度過高時則會抑制微生物的生長，甚至造成毒害。

而研究表明，已知歐典螺旋霉素中有四種不同且難以分離的雜質，而不同的金屬離子對歐典螺旋霉素雜質有不同的影響。本人在培養基中加入不同金屬離子[4]，篩選出對主要雜質影響最為顯著的金屬離子，減少雜質，優化歐典螺旋霉素的發酵組分。

將各種金屬離子分別加入到培養基中，以測定SPM效價的方法進行最終效果的鑒別，見表1。

表1 培養基中加入不同金屬離子的實驗序號

根據SPM評價效價結果如下表2 。

表2 加入各金屬離子的發酵組分及其產量

從表可以看出，各個金屬離子對于歐典螺旋霉素主產物、雜質效價均有影響，SPM的含量和雜質的總量呈一種平衡關系。硫酸銨和硝酸銨和氯化鉀對雜質C的影響較大，氯化鉀、硫酸鋅以及氯化鈷對雜質A和D的影響較大，以氯化鈷的影響最為顯著，且氯化鈷對雜質C的影響也很大，其次為硝酸銨。

2.2 生產發酵工藝的優化

歐典螺旋霉素的產量以及純度都與種子液有著密不可分的關系，而種子液的質量又取決于培養基組成成分、培養溫度、培養時間以及接種量等因素。

表3 培養基不同成分的實驗序號

結合以上根據金屬離子對歐典螺旋霉素雜質的組成成分以及比例都有顯著的影響，因此把硫酸銨、硝酸銨、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鈷都加入培養基中，加入其它可能影響種子液生長情況以及SPM含量的試劑，改變培養時間，觀察菌種濃度以及生長情況，選擇生長情況良好檢測效價。

另外，在檢測雜質的過程中，我們發現雜質A的結構只比主產物SPM1缺少一個甲基，因此，嘗試加入甲基化試劑，檢測是否能加強甲基化作用，減少雜質含量，增加主產物SPM1比例。

2.2.1 培養基成分優化

原有的培養基成分營養不夠豐富，氮源、碳源成分易耗盡，影響菌體的繁殖，而且也不利于產物的積累。因此增加碳源和氮源的比例，調整種子培養基的碳氮比。優化方案斜面孢子培養基不變，種子培養基以及發酵培養基中在加入金屬離子的基礎上添加更多的碳源和氮源。

進行48h，37℃的培養。結果如下表4。

表4 不同培養基菌體生長情況以及效價評定

從結果來看，原種子培養基玉米糊改成1%+金屬離子的培養基對于種子液的生長情況以及主產物SPM1的產量和螺旋霉素的效價，相比而言都是更為合適的，以下培養時均用此培養基。

2.2.2 甲基化試劑的影響

選取三種甲基化試劑：葉酸、氯化膽堿以及甜菜堿。根據參考文獻，向培養基中加入終濃度為0.8g/mL的甲基化試劑[5]。

表5 加入不同甲基化試劑后雜質情況和效價評定

實驗結果表5初步證明，葉酸和甜菜堿對于減少雜質成分，提高主產物的含量沒有太大的效果，氯化膽堿對螺旋霉素的生物合成有明顯的促進作用。

2.2.3 培養時間

種子液的培養時間與發酵的效果有著密切的關系，選取種子液在菌的對數生長期時，生長繁殖都較活躍，能迅速適應發酵罐中的生長環境，獲得最大程度的產量。若是菌種生長已經處于斷枝狀態，即為已經開始老化，不宜進入發酵罐擴大培養。本人選取了24h，48h，60h，72h的培養種子液，進行分析比對。結果如下表6。

表6 不同培養時間及其菌絲生長情況

結果可以看出，培養時間為48h時最為合適，能獲得生長旺盛，質量較好的菌體。

3 討論

通過以上實驗，通過改變培養基的成分實現了歐典螺旋霉素的組分優化，得到了雜質相對較少主產物SPMⅠ能夠達到80%的螺旋霉素。但是這只是一個初步的條件選擇，比如金屬離子對雜質的改變仍然需要進一步的探討研究，還可以從菌種選育入手，優化菌種，獲得較優的突變菌種。期望較優菌種結合較優生產條件能在工業上擴大培養，獲得較好的醫學效益和經濟效益。

[1] 朱 峰,王爾健.螺旋霉素的再評價[J].中國抗生素雜志,1991,16(3):231-236.

[2] Anne BrissonNo?l , Patrick TrieuCuot , Patrice Courvalin .Mechanism of action of spiramycin and other macrolides[J].J Antimicrob Chemother ,1998,22(Suppl B)：13-23.

[3] Webster Carol, Ghazanfar Katayoun, Slack Richard. Subinhibitory and post-antibiotic effects of spiramycin and erythromycin on Staphylococcus aureus[J].J Antimicrob Chemother ,1988,22(Supple B): 33-39.

[4] 李友元，陳長華, 顧熠峰,等，基于液質聯用技術解析和降低螺旋霉素發酵雜質[J].生物工程學報，2005,21(2):275-278.

[5] 葉蕊芳, 史婷婷 ,張 燕,等，維生素螺旋霉素發酵的影響[J].化學與生物工程，2008,25(10):64-67.

(本文文獻格式：劉迎賓，徐 虹，萬 丹.歐典螺旋霉素發酵工藝以及組分的優化研究[J].山東化工，2016，45(02)：25-27.)

2015-12-07

劉迎賓(1981—)，河南駐馬店人，學士學位，工程師，主要從事抗生素發酵的研究；通訊作者：徐 虹，西北農林科技大學。

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