融合菌株轉化黃芪藥渣生產乙醇的工藝

張 英， 鄭清煉， 周裕權， 周 林（.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州50006；2.廣東藥科大學，廣東廣州50006）

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融合菌株轉化黃芪藥渣生產乙醇的工藝

張 英1， 鄭清煉1， 周裕權1， 周 林2*
（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學，廣東廣州510006）

目的 研究融合菌株轉化黃芪藥渣生產乙醇的工藝。方法 以黃芪藥渣為原料，運用篩選出的融合子D2菌株，研究分步糖化發酵、同步糖化共發酵、改進同步糖化共發酵、兩步同步糖化共發酵4種工藝路線下乙醇的生產情況，并與高產乙醇的釀酒酵母比較。結果 兩步同步糖化共發酵乙醇體積分數最高，為20.4 g/L，其次為分步糖化發酵、改進同步糖化共發酵、同步糖化共發酵。在相同工藝路線下，融合菌株生產乙醇的能力較釀酒酵母要強。結論

該工藝可促使乙醇產量得到較大幅度的提高。

黃芪；藥渣；乙醇；融合菌株

中藥藥渣來源于中成藥生產、中藥材加工與炮制、原料藥生產等，并以中成藥生產帶來的藥渣量最大，約占總量的70%。隨著我國中醫藥事業的迅速發展，全國各大中藥制藥廠的中藥渣廢棄量日益增加，年排放量達60萬噸以上［1］。目前，中藥渣利用率低，除少數生態化利用外，大多作為市政垃圾而被大量焚燒或填埋。

近年來國外研究表明，纖維質原料生產生物燃料具有廣闊的應用前景［2-7］。中藥藥渣作為廉價的木質纖維素原料，其主要成分為纖維素，其次為半纖維素。以往對纖維質原料資源化的研究大多集中于纖維素的利用，而忽略了半纖維素的生物轉化，致使乙醇產率不夠理想。課題組通過前期研究，將樹干畢赤酵母 （能利用木糖）與釀酒酵母（能利用葡萄糖）進行原生質體融合，得到既能利用葡萄糖，又能利用木糖的融合子。中藥藥渣首先經過纖維素酶和木聚糖酶處理，其中的纖維素和半纖維素分別被降解為葡萄糖和木糖，兩者均能被融合菌株利用而產生乙醇，有望在原有乙醇產量的基礎上進一步提高其得率。

本研究首先采用篩選出的生產乙醇能力最強的融合子D2，研究4種工藝路線 （分步糖化發酵、同步糖化共發酵、改進同步糖化共發酵、兩步同步糖化共發酵）下乙醇的產量。然后，在相同工藝路線下，比較高產乙醇的釀酒酵母與D2菌的生產能力，以確定融合菌株是否優于基礎菌株。

1　儀器和試劑

LDZX-50FBS立式蒸氣滅菌鍋 （上海申安醫療器械廠）；DHZ-CA振蕩器（太倉市實驗設備廠）；CR-22G離心機 （日本日立公司）。

黃芪藥渣（自制）；D2菌 （本實驗室通過原生質體融合得到）；安琪釀酒高活性干酵母 （安琪酵母股份有限公司）；酵母膏 （廣州環凱生物科技有限公司）；蛋白胨 （廣州環凱生物科技有限公司）；葡萄糖 （天津市福辰化學試劑廠）；瓊脂 （廣州環凱生物科技有限公司）；復合纖維素酶（廣州翔博生物科技有限公司）；多效木聚糖酶 （廣州翔博生物科技有限公司）。（NH4）2HPO4、MgSO4·7H20、NaOH、H2SO4、乙醇均為分析純。

2　實驗方法

2.1種子的制備

2.1.1菌種的活化 活化培養基為1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂。將D2菌從保藏培養基接種一環至活化培養基的平板，30℃下培養24 h。

2.1.2種子的制備 種子培養基為1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。從活化培養基的平板上接種一環D2菌至15mL種子培養基 （發酵實驗每個樣品接種5 mL，重復3份），30℃、150 r/min下培養24 h。

2.2藥渣的預處理 稱取已平衡水分的黃芪藥渣10 g，倒入250mL燒瓶中，加入150mL 1.0%稀硫酸，于120℃下保溫2 h，處理后的樣品轉入250 mL血清瓶中。

2.3發酵培養基的制備 上述樣品加入酵母膏 （0.3%）、（NH4）2HPO4（0.025%）、MgSO4·7H20（0.025%），配制好的培養基用NaOH溶液調節pH 4.8，121℃下滅菌20 min。

2.4融合菌株轉化黃芪藥渣的工藝研究

2.4.1分步糖化發酵工藝 在 “2.3”項下發酵培養基中加入20 g復合纖維素酶、10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min酶解96 h。酶解產物于16 000 r/min轉速下離心20 min，上清液轉入250mL血清瓶中，115℃下滅菌20 min。冷卻后，接入5mL種子，30℃、150 r/min下發酵96 h。

2.4.2同步糖化共發酵工藝 在 “2.3”項下發酵培養基中加入20 g復合纖維素酶、10 g多效木聚糖酶、5 mL種子，30℃、150 r/min下發酵96 h。

2.4.3改進同步糖化共發酵工藝 在”2.3”項下發酵培養基中加入20 g復合纖維素酶、10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min下酶解8 h。再接入5 mL種子，30℃、150 r/min下發酵96 h。

2.4.4兩步同步糖化共發酵工藝 在 “2.3”項下發酵培養基中加入10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min下酶解8 h。再接入5 mL種子，加入5 g復合纖維素酶，30℃、150 r/min下發酵48 h。再加入剩下的15 g纖維素酶，繼續發酵48 h。

2.4.5具體工藝路線 見圖1。

2.5融合菌株D2與安琪釀酒高活性干酵母產酒精能力的比較 采用同步糖化共發酵工藝，融合菌株組接入的種子為5 mL液態種子，酵母組接入0.5 g活性干酵母粉。

2.6樣品中乙醇含有量的測定 參考文獻 ［8］。

3　實驗結果與分析

3.1不同工藝路線融合菌株轉化黃芪藥渣產乙醇的情況

各工藝路線下樣品的氣相色譜圖見圖2（傳統與改進同步糖化共發酵的分離效果不理想，故圖譜略去），乙醇含有量見表1。

從表可知，兩步同步糖化共發酵工藝優于傳統和改進同步糖化共發酵，其原因一方面，可能是前者在前8 h內只加入木聚糖酶，發酵液中剛開始只有木糖而沒有葡萄糖，當菌種加入后則首先利用木糖，對乙醇產量的提高起著至關重要的作用［9-10］；另一方面，8 h后在發酵液中只加入25%纖維素酶，使得發酵液在接下來48 h內葡萄糖產量不是太高，融合子能夠繼續利用發酵液中的木糖。文獻 ［11-12］報道，當發酵培養基中既有葡萄糖又有木糖存在的情況下，菌體首先會利用葡萄糖，兩步同步糖化共發酵工藝克服了這一弊端，木糖的高效利用可導致乙醇產量的提高。另外，分步糖化發酵工藝得到的乙醇含有量也高于兩者，可能是由于藥渣酶解時間較長，葡萄糖和木糖產量較高，使得發酵液中生物量較大，并最終得到較高產量的乙醇。

圖1　各工藝路線圖

表1　乙醇含有量（±s，n=3）

工藝路線　　乙醇/（g·L-1）20.4±1.5 17.3±0.9同步糖化共發酵　14.5±1.4改進同步糖化共發酵　16.3±1.2兩步同步糖化共發酵分步糖化發酵

3.2融合菌株D2與安琪釀酒高活性干酵母產酒精能力的比較 融合菌株和釀酒酵母均采用同步糖化共發酵工藝進行發酵，而且其參數為釀酒酵母發酵產乙醇最優的條件，氣相色譜圖見圖3。結果，在相同工藝路線下，D2菌產乙醇的能力較釀酒酵母強，前者乙醇含有量為14.5 g/L，后者為12.6 g/L。由此表明，該融合子具備雙親的特征，既能利用葡萄糖，又能利用木糖，融合菌株在釀酒酵母的基礎上得到改良。

圖2　各工藝路線氣相色譜圖

4　結論與討論

國內外對纖維質原料轉化為生物燃料進行了幾十年的研究，從最初的只能利用葡萄糖分步和同步糖化發酵，到后來的分步和同步糖化共發酵，工藝路線得到不斷改進，而本實驗對同步糖化共發酵工藝進一步完善，采用兩步同步糖化共發酵。首先，前酶解時只加入木聚糖酶，讓發酵液中先產生木糖，保證半纖維素的高效利用。之后加入25%纖維素酶，使葡萄糖保持一個比較低的含有量。最后加入剩下的纖維素酶。此工藝較傳統和改進同步糖化共發酵下乙醇的產量都要高，達到20.4 g/L。同步糖化共發酵是在酶解時，葡萄糖和木糖的發酵均在一個容器內進行，與分步糖化發酵相比有諸多優點，如降低成本、減少過程時間、減少污染風險等。此工藝成為現今研究的熱點，而同步糖化共發酵工藝還有進一步完善的空間，同時其過程機制還需要作進一步探討。

本實驗同時比較了高活性釀酒酵母和融合子D2菌產酒精能力，發現在同樣的工藝路線下，后者乙醇產量高，表明樹干畢赤酵母和釀酒酵母經原生質體融合后，菌種得到了改良。

只有優良的菌種和優化的工藝才能帶來理想的結果，故后續將通過對過程進行動力學研究，以期得到更加優化的工藝參數，并最終得到更高產量的乙醇。

圖3　不同菌株發酵樣品氣相色譜圖

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Q946

B

1001-1528（2016）06-1421-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.049

2015-09-06

國家自然科學基金資助項目 （81403193）；廣州中醫藥大學 “青年英才培養工程”資助項目 （QNYC20140112）；廣東省自然科學基金項目 （2014A030313587）

張 英（1976—），女，副教授，研究方向為工業三廢的處理和資源化利用。E-mai1：tjxyzyzy@163.com

周 林（1977—），男，講師，研究方向為生物活性物質及其利用。E-mai1：zhou1in@gdpu.edu.cn