蒽貝素對膠原誘導性關節炎大鼠IL-6和IL-17A的影響

余納　蔡小燕　林小軍　唐莼　葉靜華　李偉念

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·基礎研究論著·

蒽貝素對膠原誘導性關節炎大鼠IL-6和IL-17A的影響

余納蔡小燕林小軍唐莼葉靜華李偉念

目的探討蒽貝素治療類風濕關節炎(RA)的可能作用機制。方法選取Lewis雌性大鼠建立膠原誘導性關節炎(CIA)模型，將造模成功的大鼠隨機分為CIA模型組、甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組 4組，另設正常對照組，每組各8只大鼠。其中甲氨蝶呤組予甲氨蝶呤0.5 mg/kg、每周2次，蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組分別予每日1次相應劑量蒽貝素灌胃，正常對照組及CIA模型組灌服等體積溶媒。共給藥21 d，期間每周評估大鼠足趾腫脹程度，實驗結束時行腹主動脈取血，ELISA法測血清IL-6和IL-17A含量，比較各組間的差異。結果治療第14日， CIA大鼠雙側足趾均較正常對照組大鼠腫脹(P均<0.01)；隨著治療時間的延長，甲氨蝶呤組與蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組大鼠的鼠爪腫脹較CIA模型組明顯好轉(P均<0.01)，甲氨蝶呤組與蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。影像學觀察，CIA模型組出現骨質疏松、關節間隙模糊、狹窄，甲氨蝶呤組與蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組存在輕度骨質疏松，足趾小關節間隙清楚，尚未變窄。治療后，甲氨蝶呤組與蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組血清IL-6和IL-17A水平均低于CIA模型組(P均<0.01)，其中甲氨蝶呤組與蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組血清IL-6水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，蒽貝素組20 mg/kg組和40 mg/kg組的血清IL-17A水平均低于甲氨蝶呤組(P均<0.05)，但甲氨蝶呤組與蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組血清IL-6和IL-17A水平與正常對照組比較差異仍有統計學意義(P均<0.05)。結論蒽貝素可能通過抑制Th17細胞分化信號通路中相關靶點，降低血清IL-6和IL-17A，緩解關節炎癥狀。

蒽貝素；膠原誘導性關節炎；甲氨蝶呤；白介素-6；白介素-17A

類風濕關節炎(RA)是一種病因不明的自身免疫性疾病，其病理表現為關節滑膜的慢性炎癥、血管翳的形成及關節軟骨、骨組織破壞，最終導致關節畸形和功能障礙，是患者喪失勞動力和致殘的主要原因之一[1]。1980年以來，甲氨蝶呤作為抗RA的基礎藥物在臨床廣泛應用，但也有報道其療效欠佳及患者不耐受的情況[2]。隨著分子免疫學的發展，對T細胞的研究越來越深入，眾學者指出CD4+T細胞應分為輔助性T細胞1(Th1)、Th2、調節性T細胞(Treg)和Th17細胞4大亞群，其中Th17/Treg細胞亞群失衡在RA發病中具有重要的作用，且以Th17細胞占優勢[3]。以Th17細胞作為靶點的藥物研究已成為近年抗RA藥物研究領域的一個熱點。有文獻報道，蒽貝素具有抑制炎癥因子表達、促進凋亡及抗腫瘤等藥理作用[4-6]。最新研究指出，蒽貝素可抑制Th17細胞分化信號通路中相關靶點[7-8]。目前，筆者尚未見蒽貝素應用于RA治療的相關報道。故本研究以膠原誘導性關節炎(CIA) 大鼠為模型，觀察蒽貝素對CIA大鼠關節炎癥及血清中IL-6、IL-17的影響，初步探討蒽貝素治療RA的可能作用機制。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物

50只SPF級Lewis雌性大鼠，購于北京維通利華公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001，體質量170～190 g，飼養于中山大學生命科學學院中藥與海洋藥物實驗室；SPF級動物房溫度控制在(23±2)℃，12 h晝夜循環。本實驗方案通過該實驗單位的動物倫理委員會審查，遵守實驗動物福利倫理原則。

2. 主要試劑與儀器

主要試劑：蒽貝素(純度>98%)，廣西壯族自治區中醫藥研究院提供；甲氨蝶呤(每片2.5 mg)，上海信誼藥廠有限公司生產，批號036150603；牛Ⅱ型膠原(CⅡ)，完全弗氏佐劑(CFA) 和不完全弗氏佐劑(IFA)，購自美國Chondrex公司；IL-6和IL-17A ELISA 試劑盒購自上海欣博盛生物科技有限公司。主要儀器：濟南益延科技發展有限公司YLS-7C足趾容積測量儀，奧地利CliniBio 128C-340全自動酶標儀，日本Mikasa HF100HA高頻全自動動物X光機。

二、實驗方法

1. 動物模型的制備

所有大鼠適應性飼養1周，隨機分為正常對照組(8只)和CIA模型組(42只)。將4 g/L的CⅡ與等量CFA或IFA混合，用組織勻漿器乳化，制備好的乳劑(CⅡ終濃度為2 g/L)置4℃保存備用。初次免疫(第1日)取CⅡ及CFA，CIA模型組每只大鼠分3點皮內注射，即背部(靠近尾部)左右2點分別注射0.2 ml，尾根部注射0.1 ml；第7日采用同樣的方法，取CⅡ及IFA皮下注射0.1 ml加強免疫1次，注射部位為尾部基底3 cm處。正常對照組大鼠同時在相同部位注射等體積的生理鹽水。

2. 動物分組及給藥

初次免疫后第14日，挑選成模大鼠32只[炎癥評分>2分，評分依據大鼠每爪臨床癥狀評分：正常為0分、輕微的紅腫(單趾)為1分、紅腫(大于1趾)為2分、關節紅腫為3分、關節和全爪紅腫且關節不能彎曲為4分，每側關節最高4分，每只大鼠炎癥評分最高為16分]，隨機分為CIA模型組、甲氨蝶呤組、蒽貝素低劑量組和高劑量組，每組8只大鼠。依據蒽貝素的急性毒性實驗及抗RA藥效的預實驗確定本研究中蒽貝素的給藥劑量分別為20、40 mg/kg[9]。由于蒽貝素為對苯醌類物質，不溶于水，本研究將其混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)進行灌胃給藥，每日1次；甲氨蝶呤組的給藥劑量參考文獻[10]設為0.5 mg/kg，每周2次。正常對照組和CIA模型組每日給予0.5%CMC-Na 0.1 ml/kg。治療從初次免疫后第14日開始，連續治療3周，于第36日處死大鼠。

3. 檢測指標及方法

足趾容積測量：沿大鼠踝關節處畫線，于第1、7、14、21、28、35日用YLS-7C足趾容積測量儀測定大鼠足趾體積，每側測量3次，結果取平均值。測量值及初次免疫前足趾容積均為左、右足趾之和。以免疫前足趾容積為基礎，每周觀察鼠爪腫脹情況，記錄容積增加的百分比。足趾容積變化情況=(測量值-初次免疫前足趾容積)/初次免疫前足趾容積×100%。

影像學檢查：初次免疫后第36日，對實驗大鼠進行影像學檢查，應用高頻全自動動物X光機拍片，在CR數字成像系統下觀察大鼠踝關節病變情況。

血清IL-6和IL-17A水平的檢測：采用ELISA法，于實驗第36日，將全部大鼠用10%水合氯醛麻醉，固定后腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，取上清液置于-20℃保存，依照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測IL-6和IL-17A，反應終止后應用酶標儀檢測吸光度，依據樣品標準曲線計算IL-6和IL-17A水平。

三、統計學處理

結　　果

一、各組大鼠一般情況比較

CIA組大鼠在2次免疫后于第10日開始陸續出現后肢紅腫，逐漸蔓延至前肢，癥狀進行性加重，于第19～21日達到高峰，嚴重者不能負重，關節炎病變十分明顯，且有精神萎靡、進食量減少、輕微脫毛等現象；甲氨蝶呤組大鼠在治療后第6日、蒽貝素20 mg/kg組大鼠在治療后第2日各死亡1只。治療結束后，各組大鼠后足趾腫脹程度如圖1所示。

圖1　各組大鼠右后足趾腫脹程度比較

A：正常對照組；B：CIA模型組；C：甲氨蝶呤組；D：蒽貝素20 mg/kg組；E：蒽貝素40 mg/kg組

二、各組大鼠足趾容積變化

治療前(第14日)，各組CIA大鼠雙側足趾容積均較正常對照組大鼠增加(F=22.593，P<0.001；正常對照組 vs. CIA模型組、甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為8.355、10.665、7.917、10.999，P均<0.001)；第14日初始治療時，各組CIA大鼠足趾容積比較差異無統計學意義(F=0.106，P=0.956)，隨著治療周期的延長，各藥物治療組(甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組及蒽貝素40 mg/kg組)大鼠較CIA模型組的鼠爪腫脹明顯好轉(第21日F=6.062、P=0.003，CIA模型組 vs. 甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為2.942、3.721、3.308，P均<0.05；第28日F=10.794、P<0.001，CIA模型組 vs. 甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為4.714、4.964、6.316，P均<0.01；第35日F=6.520、P=0.002，CIA模型組 vs. 甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為3.665、3.754、5.340，P均<0.01)，但3個治療組組間比較差異均無統計學意義(第21～35日，甲氨蝶呤組 vs.蒽貝素20 mg/kg組t分別為0.678、0.559、0.201，P均>0.05；甲氨蝶呤組 vs.蒽貝素40 mg/kg組t分別為0.267、0.709、0.782，P均>0.05；蒽貝素組20 mg/kg vs. 蒽貝素40 mg/kg組t分別為0.420、0.126、0.554，P均>0.05)。

與CIA模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

三、各組大鼠影像學檢查情況

正常對照組大鼠踝關節X線片顯示軟組織無腫脹，關節結構完整，骨質無破壞，足趾小關節間隙清楚；CIA模型組大鼠足及踝關節周圍軟組織腫脹，關節間隙模糊、狹窄，骨關節邊緣模糊不清骨質破壞等；甲氨蝶呤及蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組雖存在輕度骨質疏松，但足趾小關節間隙清楚，尚未變窄。

四、各組大鼠的血清IL-6和IL-17A水平比較

各組大鼠血清IL-6(F=35.595，P<0.001)和IL-17A(F=53.876，P<0.001)水平比較差異均有統計學意義。甲氨蝶呤及蒽貝素20 mg/kg組和40 mg/kg組血清中IL-6和IL-17A均低于CIA模型組(IL-6：CIA模型組vs.甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為7.176、6.726、8.536、P均<0.001；IL-17: CIA模型組 vs.甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為6.079、7.877、8.442，P均<0.001)，但仍高于正常對照組(IL-6：正常對照組 vs. CIA模型組、甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為11.002、-3.961、-4.065、-2.553， P均<0.05；IL-17：正常對照組 vs. CIA模型組、甲氨蝶呤組、蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組t分別為-14.184、-8.389、-6.048、-5.943，P均<0.001)，見圖4。血清IL-6水平方面，甲氨蝶呤組與蒽貝素20 mg/kg組及蒽貝素40 mg/kg組間比較差異均無統計學意義(甲氨蝶呤組 vs. 蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組的t分別為-0.229、1.408，P均>0.05)。血清IL-17A水平組間比較，蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組均低于甲氨蝶呤組(甲氨蝶呤組 vs. 蒽貝素20 mg/kg組、蒽貝素40 mg/kg組的t分別為2.056、2.446，P均<0.05)。蒽貝素20 mg/kg和40 mg/kg組血清IL-6和IL-17A水平比較差異均無統計學意義(IL-6：t=1.589；IL-17A，t=0.307，P均>0.05)。

圖3　各組大鼠影像學檢查情況

A：正常對照組；B：CIA模型組；C：甲氨蝶呤組；D：蒽貝素20 mg/kg組；E：蒽貝素40 mg/kg組

圖4　各組大鼠血清IL-6和IL-17A水平比較

與CIA模型組比較，**P<0.01；與甲氨蝶呤組比較，# P<0.05

討　　論

RA是一種復雜的難治性自身免疫性疾病，具體發病機制尚未完全清楚。20世紀80年代以來，甲氨蝶呤作為抗RA的基礎藥物在臨床廣泛應用，但也有報道其療效欠佳及患者不耐受的情況[2]。隨著分子免疫學的發展，對T細胞的研究越來越深入，眾學者指出CD4+T細胞應分為Th1、Th2、Treg和Th17細胞四大亞群，Th17/Treg細胞亞群失衡在RA發病中具有更為重要的作用，且以Th17細胞占優勢[3]。新近研究更加細致明確地闡述了Th17細胞參與RA病程的可能機制：①Th17細胞效應因子IL-17刺激滑膜細胞和巨噬細胞分泌炎癥介質，引起RA炎癥反應[11]。②誘導滑膜細胞基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，抑制軟骨細胞合成，促進軟骨降解[12]。③Th17細胞膜上高表達的核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)可與破骨細胞前體RANK結合，從而導致破骨細胞前體分化為破骨細胞(RA骨侵蝕的重要因素)[13]。④誘導成骨細胞及滑膜細胞表達RANKL，增強破骨細胞活性，從而促進了破骨細胞的發育，引起骨質破壞[14]。

Th17細胞在RA的發生、發展中起關鍵作用，而且高水平的Th17細胞表達可能影響生物制劑的療效。譽秀華等[15]在臨床緩解期對RA患者行外周血Th17檢測，指出RA患者外周血中Th17比例明顯增高，血清中IL-17和IL-6的水平也有明顯提高。傳統的改善病情抗風濕藥物療效有限，需要聯合用藥才能降低Th17細胞[16]。所以將Th17細胞作為靶點的藥物研究已成為近年來抗RA藥物研究領域的一個熱點。IL-17是誘導Th17產生的最重要細胞因子，也是一種強有力的炎癥細胞因子，可以誘導多種促炎因子的產生，比如IL-6、TNF-α、IL-1β等。TNF-α、IL-1β等炎癥因子筆者已在前期研究中分析過，本研究著重IL-17與IL-6的含量變化，探討蒽貝素抗RA的可能藥理作用機制。

姜姝姝等[17]提出Th17-信號傳導與轉錄激活子3(STAT3)構成了RA促炎癥反應的正反饋通路。他們認為，STAT3信號通路在Th17細胞的分化、致炎過程中扮演著重要的角色。在Th17細胞分化過程中，致炎因子IL-6能夠誘導STAT3的活化從而激活STAT3通路，IL-6與TNF-α共同促使初始T細胞向Th17細胞的分化，活化中的STAT3信號通路能夠激活維甲酸相關孤核受體γt(RORγt)的表達，從而誘導Th17細胞分泌IL-6、IL-17等細胞因子。由Th17細胞分泌的IL-6、IL-17繼續參與上述過程，反饋性調節JAK/STAT通路，使得整個RA的炎癥級聯反應不斷放大[14]。針對STAT3作用靶點，劉暢等[18]應用關節腔注射siRNA干擾沉默STAT3，使膠原誘導大鼠滑膜組織中STAT3 mRNA和蛋白表達水平降低，可明顯改善CIA大鼠關節的組織病理學表現。

蒽貝素初始作為X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的有效抑制劑，常被用于抗腫瘤的藥物研究中[19]。隨著腫瘤免疫微環境概念的提出，Marsh等[20]學者發現蒽貝素可降低腫瘤相關性炎癥因子，如IL-1、IL-6、TNF-α。蒽貝素的藥理作用廣泛，Zhou等[21]將蒽貝素應用于膿毒癥模型大鼠，可有效降低促炎性細胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6，減輕全身炎癥反應，改善器官損傷。在Th17介導的免疫炎癥方面，Dai等[22]建立結腸炎相關癌癥(CAC)模型，發現蒽貝素可抑制結腸IL-6的表達和分泌及STAT3的活化，降低CAC小鼠的發病率及縮小腫瘤體積；通過體外試驗證實，在結腸癌細胞中蒽貝素可通過刺激Src同源結構域2蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP2)活性減少兩者組成和IL-6誘導的STAT3活化。

本研究表明，蒽貝素可有效緩解CIA大鼠的足趾腫脹程度，灌胃治療21 d后，影像學觀察雖存在輕度骨質疏松，但足趾小關節間隙清晰；血清中IL-6和IL-17A明顯低于CIA模型組，且蒽貝素組血清IL-17A含量低于甲氨蝶呤組；蒽貝素40 mg/kg組血清IL-6和IL-17A含量較蒽貝素20 mg/kg組均有降低，但比較差異無統計學意義，可能與劑量間隔較小、未動態連續監測血液相關指標或炎癥因子反應存在多條反饋通路有關。研究結果提示，蒽貝素可能通過Th17-STAT3通路，降低異常分泌增多的炎癥因子，緩解關節炎癥狀。研究結果表明，蒽貝素具有一定的抗炎作用，對治療RA有一定療效，但其具體作用機制仍待進一步研究。

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(本文編輯：林燕薇)

Effect of embelin on the expression of IL-6 and IL-17A in collagen-induced arthritis rat models

Yu Na, Cai Xiaoyan, Lin Xiaojun, Tang Chun, Ye Jinghua, Li Weinian.

Department of Rheumatology & Immunology, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, China

ObjectiveTo evaluate the effect and potential mechanism of embelin in the treatment of rheumatoid arthritis (RA). MethodsLewis female rats were selected to establish collagen-induced arthritis (CIA) models. Then, the rat models were randomly divided into the CIA model, methotrexate, 20 mg/kg and 40 mg/kg embelin groups (n=8 for each group). Another 8 normal rats was as control group. In the methotrexate group, the rats were administered with 0.5 mg/kg methotrexate twice a week. In the embelin groups, intragastric gavage of 20 and 40 mg/kg of embelin was delivered. In the control and CIA model groups, an equivalent quantity of solvent was given. The medicine was administered for 21 d. The degree of toe swelling was evaluated every week. After corresponding medicine administration, blood sample was collected via the abdominal aorta and prepared for measurement of serum levels of IL-6 and IL-17A. The data were statistically compared among different groups. ResultsAfter 14-d treatment, bilateral toe swelling in the CIA model group was significantly more severe compared with that in the control group (all P<0.01). Along with the course of treatment, the symptoms of toe swelling in the methotrexate, 20 and 40 mg/kg embelin groups were evidently alleviated compared with those in the CIA model group (all P<0.01), whereas no statistical significance was noted among methotrexate, 20 and 40 mg/kg embelin groups (all P>0.05). Imaging examination revealed the signs of osteoporosis, indistinct joint space, stenosis in the methotrexate group, and slight osteoporosis, clear joint space but no stenosis was noted in methotrexate, 20 and 40 mg/kg groups. After treatment, the mean serum levels of IL-6 and IL-17A in the methotrexate, 20 and 40 mg/kg embelin groups were significantly down-regulated compared with those in the CIA model group (all P<0.01), whereas no statistical significance was observed in IL-6 levels among the methotrexate, 20 and 40 mg/kg embelin groups (all P>0.05). The mean serum levels of IL-17A in the 20 and 40 mg/kg embelin groups were considerably lower than that in the methotrexate group (both P<0.05).The serum levels of IL-6 and IL-17A in the methotrexate, 20 and 40 mg/kg embelin groups significantly differed from that in the control group (all P<0.05). ConclusionEmbelin can mitigate the symptoms of joint inflammation probably via suppressing the targets in the signaling pathway of Th17 cell differentiation and down-regulating the serum levels of IL-6 and IL-17A.

Embelin; collagen-induced arthritis; Methotrexate; Interleukin-6; Interleukin-17A

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.08.004

廣東省中醫藥局科研課題(20151015)

510180 廣州，廣州市第一人民醫院風濕免疫科

2016-05-07)