miRNA-200b通過靶向VEGF抑制視網膜母細胞瘤細胞生長與侵襲

劉越峰　羅衛民　張勇　鐘曉東

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·基礎研究論著·

miRNA-200b通過靶向VEGF抑制視網膜母細胞瘤細胞生長與侵襲

劉越峰羅衛民張勇鐘曉東

目的明確miRNA-200b是否通過調控靶向血管內皮生長因子(VEGF)的表達而抑制視網膜母細胞瘤細胞的生長與侵襲，進一步揭示miRNA-200b抗腫瘤的分子機制。方法將視網膜母細胞瘤Y79細胞分成6組：miRNA-200b、miRNA-NC、sh-VEGF、shRNA-NC、miRNA-200b+sh-VEGF、miRNA-NC+shRNA-NC組。熒光素酶報告系統檢測miR-200b對VEGF的3’-非翻譯區熒光素酶活性的影響；蛋白免疫印跡法檢測sh-VEGF轉染的干擾效果；MTS實驗與Transwell侵襲實驗分別檢測上述各組對視網膜母細胞瘤細胞增殖與侵襲的影響。結果熒光素酶報告檢測結果顯示，miR-200b能特異性地與VEGF的3’-非翻譯區結合，并抑制其熒光素酶的活性；蛋白免疫印跡法顯示，sh-VEGF轉染組中VEGF的蛋白表達水平較對照組明顯下調；MTS實驗結果顯示，轉染miRNA-200b 組與sh-VEGF組48 h后視網膜母細胞瘤細胞的生存率均低于各自對照組(P均<0.05)；而共轉染miRNA-200b+sh-VEGF組 48 h后視網膜母細胞瘤細胞的生存率低于對照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組(F=9.887,P均<0.05)；Transwell侵襲實驗顯示，轉染miRNA-200b組與sh-VEGF組48 h后視網膜母細胞瘤細胞的穿膜能力均低于各自對照組(P均<0.05)；而共轉染miRNA-200b+sh-VEGF組 48 h后視網膜母細胞瘤細胞的穿膜能力低于對照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組(P均<0.05)。結論miRNA-200b通過靶向調控VEGF的表達而抑制視網膜母細胞瘤細胞的生長與侵襲。

視網膜母細胞瘤；微小RNA-200b；血管內皮生長因子生長；侵襲

視網膜母細胞瘤的治療目的以根治腫瘤和保護有效視力為主，但是一些放射治療和化學治療的方式可能引起干眼病、視神經病變、視網膜病變、白內障或繼發于眼眶發育不良的面部畸型等病癥，眼球的摘除術會使病人永久性的喪失患側視力；而繼發的腫瘤及視網膜母細胞瘤的轉移更是致命性的，因此現有的治療效果常常是有限的[1]。基因治療的發展也為視網膜母細胞瘤的治療提供了新的方法，可避免徹底地眼球摘除或放化療等帶來的繼發疾病，因此有效作用靶點的尋找也成為了一個熱點。

微小RNA(miRNA)為內源性的非編碼小分子RNA，在轉錄后水平對表達進行負調控，包括個體發育、細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡等多方面。研究表明，miRNA-200b與多種腫瘤的生長增殖及復發轉移等密切相關，如胃癌、乳腺癌、膠質瘤等[2-4]。血管內皮生長因子(VEGF)為一種內皮細胞特異的有絲分裂原，高表達的VEGF不僅可促進腫瘤的血管新生，且與腫瘤的浸潤及轉移有密切關系。VEGF的高表達意味著腫瘤的遠處轉移及復發的危險性增強，術后的生存期下降[5]。VEGF也可減低小鼠足細胞的黏附性，激活PI3K/Akt信號通路[6]。本研究中，我們擬證實miRNA-200b可通過靶向調控VEGF蛋白的表達而抑制視網膜母細胞瘤細胞生長與侵襲，并進一步探討miRNA-200b在視網膜母細胞瘤中的抑瘤功能及內在分子機制。

材料與方法

一、主要材料

miRNA-200b 模擬物(miRNA-200b)及無關序列對照(miRNA-NC)從美國Ambion公司購買，miRNA-200b 模擬物序列為，5’-TCATCATTACCAGGCAGTATTA-3’，miRNA-NC序列為 5’-AATGGAACGATACAGAGTAGATT-3’， VEGF Short Hairpin RNA(shRNA) Lentiviral Particles (Human, sc-108080)重組載體pRFP-C-RS(VEGF shRNA)及其對照為shRNA-NC，鼠單抗人VEGF和鼠單抗GAPDH購買于美國Santa cruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗購買于武漢博士德公司。pcDNA 3.1-VEGF重組載體(A DNA sequence encoding the mature form of human VEGF)、VEGF、pcDNA3.1空載體對照(vector)、突變型VEGF的3’-非翻譯區(3’-untranslated region，3’-UTR)的熒光素酶報告載體(VEGF-mut)和野生型VEGF的3’-UTR的熒光素酶報告載體(VEGF-wt)由廣州市復能基因公司成功構建。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購買于美國Promega公司，Lipofectamine 2000轉染試劑和Trizol購買于美國Invitrogen公司。PRIM1640和Opti-MEM培養基以及胎牛血清購買于美國Gibco公司。MTS細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒購買于美國Sigma公司。人視網膜母細胞瘤Y79細胞購買于中科院上海生化細胞研究所。蛋白提取試劑盒購買于上海 BestBio 貝博生物公司。BCA和增強化學發光(Enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購買于美國Pierce公司，Transwell小室及基質膠等相關試劑購買于美國BD公司。

二、細胞培養

人視網膜母細胞瘤細胞株Y79細胞培養于含 10% 胎牛血清(FBS)，1%青霉素-鏈霉素溶液和2 mmol/L的谷氨酰胺的RPMI-1640培養基中，在37℃、5% CO2的細胞培養箱內。Y79細胞培養時呈單層貼壁生長，細胞匯合度達到80%～90%時，傾棄培養液，用PBS洗3遍，隨后用0.25% 胰酶消化，在顯微鏡下觀察見細胞間隙增大后，隨即傾棄胰酶，加入含10% FBS的RPMI-1640培養基，并吹打細胞使其成單細胞懸液，常規傳代。

三、瞬時轉染miRNA和質粒

收集培養瓶中預先培養至約80%左右密度的細胞，用含10% FBS的RPMI-1640培養液稀釋，吹打制成5×104細胞/ml的單細胞懸液，按2 ml/孔鋪至6孔板中，100 μl/孔鋪至96孔板中，并放置在5% CO2、37℃的細胞培養箱中，待細胞密度達60%～80%時用于轉染。接種細胞于6孔或96孔板中，待完全培養基中細胞生長至30%～50%密度時，在無菌EP管中配好Lipofectamin 2000及待轉染試劑；室溫放置20 min，使脂質體與DNA形成復合體；用無血清培養液洗滌培養瓶中的細胞。然后向復合體中加入無血清培養液(不含抗生素)，溫和地混勻，加入到待轉染的6或96孔板中；置于37°C、5%CO2培養箱中，48 h后，收集細胞并抽提蛋白。

四、熒光素酶活性檢測miRNA-200b是否與VEGF的3-UTR區結合

將實驗分成4組：miRNA-200b+VEGF-wt、miRNA-NC+VEGF-wt、miRNA-200b+VEGF-mut、miRNA-NC+VEGF-mut。分別共轉染上述4組于Y79細胞48 h后，收獲細胞。按熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)的說明書用單光子檢測儀(美國Biorad公司)檢測細胞熒光素酶的活性。計算相對熒光素酶活性，公式為螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值，每組實驗重復3次。

五、蛋白免疫印跡法檢測Y79細胞中VEGF蛋白表達改變

將實驗分2組：miRNA-200b與miRNA-NC、VEGF與vector。分別轉染上述各組于Y79細胞48 h后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度。每孔分別取30 μg樣本，進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%胎牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入1∶200鼠抗人VEGF抗體或1∶1 000鼠抗人GAPDH抗體，4℃過夜。TBST洗膜30 min，加入1∶10 000辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗，并且室溫孵育1～1.5 h，TBST洗膜30 min后加入ECL發光劑，X片曝光、顯影、定影。掃描條帶后獲取并保存圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白質條帶的灰度值和內參GADPH的 蛋白灰度值比值來表示目的蛋白的相對表達水平，每組實驗均重復3次。

六、MTS法檢測miRNA-200b mimics和VEGF對Y79細胞生長增殖活性的影響

將實驗分成6組：miRNA-200b、miRNA-NC、sh-VEGF、shRNA-NC、miRNA-200b+sh-VEGF、mi-RNA-NC+shRNA-NC。分別轉染Y79細胞，每組設置6個復孔，在未接種細胞的孔中加入RPMI-1640培養基來作為調零孔。轉染后放置于37℃、5% CO2培養箱，培養48 h。每孔加入20 μl MTS檢測試劑，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min至使結晶物充分融解。隨后用酶標儀測定492 nm波長的吸光度值(OD492)。增殖活性計算公式為：(處理組-調零孔)/(對照組比-調零孔)×100%，每組實驗重復3次。先轉染好細胞，然后把轉染好的細胞消化并接種到96孔板，接種后再培養48 h。

七、Transwell侵襲實驗

在Transwell小室中鋪加基質膠稀釋液，放置過夜使其成膜。次日取100 μl細胞稀釋液接種于小室的上腔，下腔中加入500 μl含10%胎牛血清的培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養36 h后，取出并擦棄小室上層的細胞，并用甲醛固定，0.1%結晶紫染色。PBS緩沖液清洗，倒置并晾干。在光學顯微鏡下觀察，并隨機選取4個高倍視野進行細胞計數，并取平均值。

八、統計學處理

結　　果

一、VEGF為miRNA-200b直接調控的靶基因

通過TargetScan在線軟件預測，VEGF為miRNA-200b預測的靶基因；隨后將miRNA-200b和miRNA-NC分別共轉染到VEGF-wt與VEGF-mut兩組中，采用單光子檢測熒光素酶活性。結果表明miRNA-200b在VEGF-mut和VEGF-wt組中熒光素酶活性強度分別為(0.974±0.091，0.543±0.062)，兩者比較差異有統計學意義(t=3.876, P=0.018)；而miRNA-NC在VEGF-mut和VEGF-wt組的活性強度分別為(0.921±0.116，0.861±0.083)，兩者比較差異無統計學意義(t=0.421, P=0.695)，見圖1。

二、過表達miRNA-200b和下調VEGF表達抑制視網膜母細胞瘤細胞生長增殖

為驗證miRNA-200b對視網膜母細胞瘤細胞的生長增殖的影響，分別轉染sh-VEGF(100 nmol/L)和對照組(shRNA-NC)到Y79細胞中，蛋白免疫印跡法檢測干擾效果，結果表明sh-VEGF組(OD=0.547±0.041)中VEGF蛋白表達低于shRNA-NC組(OD=1.063±0.148)，2組比較差異有統計學意義(t=4.831, P=0.014，見圖2A)。

MTS法結果表明(圖2B)，轉染miRNA-200b 組Y79細胞的生存率(56±6%)低于miRNA-NC組(97±5%)，差異有統計學意義(t=5.379, P=0.005)；轉染sh-VEGF 組Y79細胞的生存率(55±4%)低于shRNA-NC組(95±7%)，差異有統計學意義(t=4.850, P=0.008，圖2B)；而共轉染miRNA-200b+sh-VEGF組Y79細胞的生存率(31±4%)低于對照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組，差異有統計學意義(F=9.887, P<0.05)。即過表達miRNA-200b和下調VEGF的表達均能抑制視網膜母細胞瘤細胞生長增殖，且過表達miRNA-200b和下調VEGF的表達具有協同作用。

圖1　miRNA-200b的靶基因預測及熒光素酶報告載系統驗證圖

A：VEGF的基因3'非編碼區(UTR)上含有一個miRNA-200b的結合位點； B：熒光素酶報告載系統檢測miRNA-200b對VEGF 3’UTR的熒光酶活性的影響；*P<0.05

圖2　MTS法檢測過表達miRNA-200b對Y79細胞增殖能力的作用

A：蛋白免疫印跡法檢測sh-VEGF轉染的干擾效果；B：各轉染組Y79細胞生存率的統計分析，與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

三、miRNA-200b通過靶向VEGF抑制Y79細胞的侵襲能力

Transwell結果表明，轉染miRNA-200b組穿出基底膜細胞數為(95±10)，低于miRNA-NC組(168±6，t=5.667, P=0.004)；轉染sh-VEGF組穿出基底膜細胞數為(84±6.2)，低于shRNA-NC組(164±13，t=5.578, P=0.005)；而共轉染miRNA-200b+sh-VEGF組穿出基底膜細胞數為(51±5)，低于對照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組，差異有統計學意義(F=8.607, P=0.001)，見圖3。表明過表達miRNA-200b或下調VEGF的表達均能抑制視網膜母細胞瘤細胞侵襲，且過表達miRNA-200b與下調VEGF的表達具有協同作用。

圖 3　Transwell侵襲實驗檢測過表達miRNA-200b對Y79細胞侵襲能力的作用

A：穿過基底膜的Y79細胞顯微照片(×200) ；B：各轉染組Y79細胞穿出數量的統計分析，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討　　論

視網膜母細胞瘤是一種常見于兒童及新生兒的視網膜惡性腫瘤，在美國5歲以下的兒童該病的發病率達1/18 000，且發展十分迅速，在南美及中美地區和發展中國家，發病率及死亡率更高[7]。視網膜母細胞瘤有遺傳和非遺傳型之分，遺傳型為常染色體顯性遺傳，多數雙眼發病，發病早且易轉移而致死；后者的基因突變僅發生在視網膜細胞，常見于單側或散發型，發病晚，無陽性家族史[8-9]。臨床上常用的治療手段包括化學治療、外放射治療、冷凍治療、溫熱治療、光凝固治療、光動力學治療和眼球摘除手術。

miRNA-200家族在腫瘤的生長、增殖、侵襲和轉移中發揮著極其重要的作用[10-11]。許多研究顯示miRNA-200b在細胞，組織和不同的腫瘤中均表達異常[12-16]。但迄今為止，很少有關于miRNA-200b在視網膜母細胞瘤中表達情況及相關功能的研究。

在本研究中，首先我們通過熒光素酶活性檢測證實VEGF為miRNA-200b的靶基因。為進一步驗證miRNA-200b對視網膜母細胞瘤細胞的生長增殖的影響，我們分別轉染sh-VEGF及對照組(shRNA-NC)到Y79細胞中，通過蛋白定量和蛋白免疫印跡法證實sh-VEGF對VEGF表達的抑制作用后，MTS法檢測細胞生長增殖活性驗證過表達miRNA-200b和下調VEGF的表達具有協同作用，即均能抑制視網膜母細胞瘤細胞生長增殖。在分別轉染VEGF及對照組(vector)到Y79細胞中，通過蛋白定量和蛋白免疫印跡法證實轉染VEGF可增加VEGF的蛋白表達后，MTS法檢測細胞生長增殖活性驗證過表達VEGF能夠逆轉miRNA-200b對視網膜母細胞瘤細胞生長增殖抑制作用。最后我們通過分別轉染VEGF、vector以及miRNA-200b與miRNA-NC、VEGF與vector、miRNA-200b+VEGF與miRNA-NC+vector到Y79細胞中，統計基底膜細胞數，發現miRNA-200b能通過靶向VEGF抑制Y79細胞的侵襲能力。

綜上所述，miRNA-200b可通過直接靶向VEGF抑制視網膜母細胞瘤的生長與侵襲，miRNA-200b可能為視網膜母細胞瘤的潛在的治療靶點，為今后該疾病的防治提供了新的切入點。

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(本文編輯：楊江瑜)

miRNA-200b inhibits retinoblastoma cell proliferation and invasion by targeting VEGF

Liu Yuefeng, Luo Weimin, Zhang Yong, Zhong Xiaodong.

Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China Corresponding author, Luo Weimin, E-mail: luoweimin0803@sina.com

ObjectiveTo explore whether miRNA-200b inhibits retinoblastoma cell proliferation and invasion by targeted-regulating the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), and further elucidate the molecular mechanism underlying the anti-tumor function of miRNA-200b. MethodsRetinoblastoma cell line Y79 was divided into miRNA-200b, miRNA-NC, sh-VEGF, shRNA-NC, miRNA-200b+sh-VEGF and miRNA-NC+shRNA-NC groups. The effect of miRNA-200b upon the luciferase activity of VEGF 3’-UTR was evaluated by luciferase assay. The intervention effect of sh-VEGF transfection was assessed by Western blot. The proliferation and invasion ability of Y79 cells in each group were evaluated by MTS and Transwell assays when transfected with miRNA-200b and miRNA-NC, sh-VEGF and shRNA-NC, miRNA-200b+sh-VEGF and miRNA-NC+shRNA-NC, respectively. ResultsLuciferase assay revealed that miRNA-200b could specifically bind with the 3’-UTR of VEGF and suppress the luciferase activity. Western blot detected that the expression of VEGF protein in the sh-VEGF transfection group was significantly down-regulated compared with that in the shRNA-NC group (P<0.05). MTS assay revealed that the survival rates of Y79 cells at 48 h after miRNA-200b and sh-VEGF transfection were considerably lower compared with those in corresponding control groups (both P<0.05). At 48 h following co-transfection with miRNA-200b and sh-VEGF, the survival rate of Y79 cells was significantly lower than those in corresponding control, miRNA-200b and sh-VEGF groups (all P<0.05). Transwell assay showed that the invasion ability of Y79 cells through the basement membrane was significantly lower compared with those at 48 h after miRNA-200b and sh-VEGF transfection (both P<0.05). At 48 h after co-transfection with miRNA-200b and sh-VEGF, the invasion ability of Y79 cells through the basement membrane was considerably lower than those in the corresponding control, miRNA-200b and sh-VEGF groups (all P<0.05). ConclusionmiRNA-200b inhibits the proliferation and invasion of retinoblastoma cells by targeted regulation of VEGF expression.

Retinoblastoma; MiRNA-200b; Vascular endothelial growth factor; Proliferation;Invasion

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.08.005

十堰市科技課題(14Y40)；湖北省教育廳科學研究計劃指導性項目(B2015477)

442000 十堰，湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院眼科中心

，羅衛民，E-mail: luoweimin0803@sina.com

2016-01-06)