蝙蝠葛堿對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)生長抑素表達(dá)的影響

張英博，潘思文，于春磊，費(fèi)洪新，張曉杰，仲麗麗，周忠光

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040）

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蝙蝠葛堿對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)生長抑素表達(dá)的影響

張英博1，潘思文1，于春磊1，費(fèi)洪新1，張曉杰1，仲麗麗2，周忠光2

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040）

為了探討蝙蝠葛堿(DAU)對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。將84只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、鹽酸多奈哌齊組和DAU高、中、低劑量組，采用立體定位儀將凝聚狀態(tài)Aβ1-42定向注射海馬區(qū)制備AD動(dòng)物模型。通過Morris水迷宮的定位航行試驗(yàn)，檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組平均逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05)，大鼠海馬區(qū)SS蛋白表達(dá)也明顯降低(P<0.05)。因此，DAU可能通過上調(diào)AD模型大鼠海馬區(qū)SS蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮防治AD的作用。

阿爾茨海默病；蝙蝠葛堿；生長抑素

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的退行性疾病，其病理學(xué)改變?yōu)樯窠?jīng)元喪失、彌漫性大腦皮質(zhì)萎縮、老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和顆粒空泡變性等。臨床上AD患者主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退、智力下降、定向障礙、人格改變等精神癥狀。

1　試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠84只，體重(210±20)g，鼠齡12W，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證SCXK（京）2012-0001。

1.2藥物與主要試劑

北豆根 (安國市燕興中藥飲片有限公司，批號(hào)100826，購買北豆根原材料后由王棟教授從北豆根中提取DAU，純度是99.6%)；多奈哌齊(重慶植恩藥業(yè)有限公司，批號(hào)20141201)；Aβ1-42(Sigma公司)；Rabbit Anti-SS(武漢博士德生物工程有限公司)；SP即用型試劑盒及DAB顯色劑(福州生物技術(shù)公司)。

1.3主要儀器

Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；江灣IC型立體定向器(第二軍醫(yī)大學(xué))。

2　試驗(yàn)方法

2.1AD模型制備

試驗(yàn)大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉后，用立體定向儀固定頭部，備皮消毒，沿顱頂中線作2cm切口，分離骨膜暴露出頭骨，于前囟向后3.0mm，中線左右各旁開2.2mm，用牙科鉆打開顱骨，微量進(jìn)樣器針頭垂直入2.8mm，將1μL溶液緩慢注入，注射時(shí)間為5min，留針5min。同時(shí)對(duì)照組和假手術(shù)組向海馬區(qū)域注射1μL生理鹽水。

2.2分組

AD模型大鼠隨機(jī)分成模型組、鹽酸多奈哌齊組和DAU高、中、低3個(gè)劑量組，每組12只。另外設(shè)定對(duì)照組和假手術(shù)組。

2.3給藥

造模后第3d開始給藥，鹽酸多奈哌齊組(0.33mg· kg-1)，DAU高、中、低各劑量組(80、40、20mg·kg-1)，其余3組給予等體積生理鹽水，共4W。

2.4Morris水迷宮試驗(yàn)

給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮行為測(cè)試。水迷宮為一不銹鋼圓形水池，直徑150cm，高60cm，內(nèi)置有機(jī)玻璃平臺(tái)，平臺(tái)高40cm，底面為6cm×10cm。在水池壁東、西、南、北部位分別標(biāo)明入水點(diǎn)。液面高于安全平臺(tái)1cm，水溫(22±1)℃，加適量奶粉使水呈乳白色，訓(xùn)練期間環(huán)境安靜，Morris水迷宮試驗(yàn)的前5d為定位航行試驗(yàn)，使其自由游泳，自動(dòng)攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期，60 s后自動(dòng)停止記錄。

2.5多聚甲醛固定

大鼠乙醚麻醉，剪開腹腔、胸腔、右心耳，針頭插入左心室，緩慢勻速灌注生理鹽水100mL，直到肝變白后緩慢勻速灌注4%多聚甲醛，取大鼠的腦組織進(jìn)行固定。

3　試驗(yàn)結(jié)果

3.1DAU對(duì)大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的影響

定位航行試驗(yàn)訓(xùn)練期間，各試驗(yàn)組大鼠逃避潛伏期總體呈下降趨勢(shì)，模型組大鼠逃避潛伏期的下降速度相對(duì)較慢。統(tǒng)計(jì)分析第5d試驗(yàn)結(jié)果，與對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和DAU各劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。

表1　DAU對(duì)大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的影響Tab.1　The effect of DUA on navigation testing escape latency in rats

3.2DAU對(duì)大鼠海馬區(qū)SS表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)SS蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，DAU高、中、低劑量組SS蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)。

表2　DAU對(duì)AD模型大鼠海馬區(qū)SS表達(dá)的影響Tab.2　The effect of DAU on hippocampus SS expression in AD rat model

4　討論

AD是逐漸進(jìn)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)特征為嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶功能下降、分析判斷能力減退、情緒改變、行為失常等。試驗(yàn)制備AD模型方法包括海馬區(qū)域注射Aβ1-42、海馬區(qū)域注射Aβ1-42、腹腔注射D-半乳糖、轉(zhuǎn)基因模型等，因此本試驗(yàn)選擇海馬區(qū)域注射Aβ1-42建立模型。

試驗(yàn)還運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)DAU對(duì)大鼠海馬區(qū)SS表達(dá)的影響，結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬區(qū)SS蛋白表達(dá)明顯減少，DAU各劑量組和鹽酸多奈哌齊組大鼠SS蛋白表達(dá)有所增強(qiáng)。提示DAU可能是通過上調(diào)SS蛋白表達(dá)，增加海馬SS免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)目和積分光密度，提示DAU對(duì)AD模型大鼠腦內(nèi)SS能神經(jīng)元有保護(hù)作用，進(jìn)而能夠改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。因此可推斷，DAU通過上調(diào)AD大鼠海馬區(qū)SS蛋白表達(dá)來改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

［1］ Lin TW，Shih YH，Chen SJ，et al.Running exercise delays neurodegeneration in amygdala and hippocampus of Alzheimer's disease(APP/PS1)transgenic mice［J］. Neurobiol Learn Mem.2015，2(118)：189-197.

［2］費(fèi)洪新，高音，孫麗慧，等.黃芪多糖對(duì)阿爾茨海默病小鼠海馬組織的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2015，35(16)：4426-4429.

［3］費(fèi)洪新，高音，孫麗慧，等.蝙蝠葛酚性堿對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(7)：91-94.

［4］費(fèi)洪新，周忠光，姜波，等.補(bǔ)陽還五湯對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬APP蛋白的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(20)：101-104.

［5］費(fèi)洪新，周忠光，韓玉生，等.補(bǔ)陽還五湯對(duì)阿爾茨海默病小鼠血腦屏障通透性的影響［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26(5)：1028-1031.

The Effect of Dauricine on Learning and Memory Ability and Hippocampus Somatostatin Expression of Alzheimer's Disease in Rats

ZHANGYing-bo1,PANSi-wen1,YUChun-lei1,FEI Hong-xin1,ZHANGXiao-jie1,ZHONGLi-li2,ZHOUZhong-guang2
(1.Qiqihar Medical College,Qiqihar 161006,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

To investigate dauricine(DAU)on learningand memory ability of Alzheimer's disease(AD)rats.The 84 SD rats were randomlydivided into control group,sham operation group,model group,donepezil hydrochloride group and DAU high,medium and low dose group,using three-dimensional positioning system to put Aβ1-42 into hippocampus with directional injection and prepared AD animal model.Through the navigation testing of Morris water maze to test the ability of rats'learning and memory.The results showed that compared with sham-operated group,the average escape latency of model group was significantly longer(P<0.05),hippocampus SS protein expression in rat was significantly reduced(P<0.05).Therefore,through upregulation in hippocampus SS protein expression of AD rats,DAU can possibly improve learning and memory ability ofADrats,and play a role in prevention ofAD.

Alzheimer's disease;Dauricine;Somatostatin

R285

A

1674-8646（2016）01-0014-02

2015-10-19

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院院內(nèi)科研基金；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士后基金(LBH-Z14196)；黑龍江省青年基金(QC2015101)

張英博(1973-)，男，博士，副教授，主要從事癡呆、腫瘤、肝纖維化研究。