芍藥苷對(duì)UVB所致HaCaT細(xì)胞凋亡的防護(hù)作用

楊秀華　陳宏泉

論 著

芍藥苷對(duì)UVB所致HaCaT細(xì)胞凋亡的防護(hù)作用

楊秀華陳宏泉

目的： 明確芍藥苷對(duì)UVB所致HaCaT細(xì)胞凋亡的防護(hù)作用。方法： 將HaCaT細(xì)胞分為8組，A組:空白對(duì)照組；B組:UVB照射對(duì)照組；C～H組分別為0.25 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L及10 mg/L芍藥苷預(yù)處理組，均照射UVB。用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，RT-PCR檢測P21mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果： B組細(xì)胞凋亡率為4.840±0.836明顯高于C～G組（0.423±0.179、1.127 ±0.535、1.633±0.417、2.570±0.439、3.137±0.347）（P＜0.05）。B組與H組（4.203±0.655）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B組P21mRNA表達(dá)為1.040±0.007明顯高于C～H組（0.440±0.015、0.551±0.013、0.857±0.017、0.848±0.027、0.850±0.052、0.923±0.035）（P＜0.05）。結(jié)論： 芍藥苷在一定濃度內(nèi)（0.25～5 mg/L）對(duì)UVB致HaCaT細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用，并能減少P21mRNA的表達(dá)。

芍藥苷； 中波紫外線； HaCaT細(xì)胞

中波紫外線（UVB）是引起皮膚光損傷的主要因素［1］，可引起細(xì)胞DNA損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致皮膚光損傷。光損傷時(shí)光產(chǎn)物本身及經(jīng)典的DNA雙鏈的斷裂（DSB）均可通過活化分子警察P53，激活下游信號(hào)蛋白P21等細(xì)胞周期激酶抑制劑［2］。P21作為P53基因下游的細(xì)胞周期調(diào)控因子，在細(xì)胞周期、DNA修復(fù)及細(xì)胞凋亡方面起著重要作用［3，4］。

研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有清除組織細(xì)胞內(nèi)自由基、抗氧化損傷等特點(diǎn)［5］，還具有保護(hù)損傷細(xì)胞、抑制細(xì)胞凋亡［6］等作用。HaCaT細(xì)胞的生物學(xué)特征與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞相似，本項(xiàng)研究采用UVB照射HaCaT細(xì)胞以建立細(xì)胞凋亡模型，以芍藥苷為光防護(hù)劑，檢測芍藥苷對(duì)UVB所致HaCaT細(xì)胞光損傷過程中細(xì)胞凋亡、P21mRNA表達(dá)的影響，以探討芍藥苷的光防護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器 95%芍藥苷由寧波立華制藥惠贈(zèng)，HaCaT細(xì)胞株由韓國延世大學(xué)丁擘曉博士授權(quán)，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院王春波教授惠贈(zèng)，UVB型紫外輻照計(jì)購自北京師范大學(xué)光電儀器廠。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 將HaCaT細(xì)胞分為8組。A組:空白對(duì)照組，不加芍藥苷，不照射UVB；B組:UVB照射組，不加芍藥苷；C組:0.25 mg/L芍藥苷組；D組:0.5 mg/L芍藥苷組；E組:1 mg/L芍藥苷組；F組:2.5 mg/ L芍藥苷組；G組:5 mg/L芍藥苷組；H組:10 mg/L芍藥苷組；C～H組均照射UVB。

1.2.2HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM-1640培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.3照射方法 待HaCaT細(xì)胞貼壁生長至80%左右融合時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，無菌條件下加入不同濃度芍藥苷。空白對(duì)照組和照射對(duì)照組只加角質(zhì)形成細(xì)胞專用培養(yǎng)基使各孔的終體積相等。細(xì)胞放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，除空白對(duì)照組外，其余組均照射UVB，照射劑量為20 mJ/cm2，照射垂直距離為10 cm。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞經(jīng)不同濃度芍藥苷處理UVB照射18 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。用PBS洗滌，離心收集細(xì)胞（1000 r/min，5 min），棄上清，用緩沖液重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將濃度調(diào)整到1×106個(gè)/mL，按照Annenxin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作規(guī)程檢測細(xì)胞凋亡率。用專用Cell Quest軟件將所得數(shù)據(jù)采進(jìn)行收集、儲(chǔ)存和分析各組HaCaT細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5P21mRNA表達(dá)量 細(xì)胞經(jīng)不同濃度芍藥苷處理并接受 UVB照射18 h后，用RT-PCR法檢測P21mRNA表達(dá)量，凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶P21/ GAPDH的灰度比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P21及GAPDH引物序列、反應(yīng)條件、擴(kuò)增產(chǎn)物分子量見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為ˉx±s，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用小樣本LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1芍藥苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響 芍藥苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響分析見圖1表2。C～G組的HaCaT細(xì)胞凋亡率明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各實(shí)驗(yàn)組間，C～E組間的凋亡率較F～H組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　內(nèi)參和GAPDH P21的引物序列

圖1　1a～h:A～H組HaCaT細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.2芍藥苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞P21mRNA表達(dá)的影響 各組均有P21mRNA的表達(dá)，GAPDH對(duì)照均出現(xiàn)明顯擴(kuò)增條帶，表明各組細(xì)胞中RNA的質(zhì)量及RT-PCR過程均良好，各組P21/GAPDH相對(duì)表達(dá)量見圖2表2。B組HaCaT細(xì)胞P21mRNA表達(dá)量最高，與B組比較各實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞P21mRNA表達(dá)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　芍藥苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞凋亡率及P21mRNA表達(dá)量的影響

表2　芍藥苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞凋亡率及P21mRNA表達(dá)量的影響

組別　　凋亡率（%）　P21mRNA表達(dá)量A組　0.047±0.015　0.584±0.023 B組　4.840±0.836　1.040±0.007 C組　0.423±0.179　0.440±0.015 D組　1.127±0.535　0.551±0.013 E組　1.633±0.417　0.857±0.017 F組　2.570±0.439　0.848±0.027 G組　3.137±0.347　0.850±0.052 H組　4.203±0.655　0.923±0.035

圖2　a:GAPDH在各組的表達(dá)；b:P21mRNA在各組的表達(dá)

3　討論

近年來，由于大氣中的臭氧層破壞，致地球表面UVB輻射強(qiáng)度逐年增加，UVB可引起DNA損傷、氧化應(yīng)激、免疫抑制、細(xì)胞凋亡等［7，8］。因此對(duì)UVB的防護(hù)成為人們關(guān)注的重要課題。細(xì)胞周期是在周期調(diào)控因子（p21、p53等）調(diào)節(jié)下進(jìn)行的嚴(yán)密有序的過程，分為S期（DNA合成期）、M期（有絲分裂期）以及把S期、M期分開的G1期（DNA合成前期）、G2期（DNA合成后期）。當(dāng)表皮細(xì)胞受到UVB刺激時(shí)發(fā)生DNA突變，p53基因首先被激活，p53蛋白表達(dá)增加，活化細(xì)胞周期蛋白激酶抑制物p21的轉(zhuǎn)錄，抑制周期蛋白激酶的活性，使細(xì)胞周期停滯于G1期，以便修復(fù)受損DNA［9］。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞周期阻滯是一種細(xì)胞自我保護(hù)性的機(jī)制［10］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，照射對(duì)照組 HaCaT細(xì)胞凋亡率明顯增加，HaCaT細(xì)胞P21mRNA表達(dá)量明顯增加，表明UVB照射HaCaT細(xì)胞后可致細(xì)胞凋亡率、P21mRNA表達(dá)量增加。相對(duì)于照射對(duì)照組，C～G組細(xì)胞凋亡率明顯減少，C～H組P21mRNA表達(dá)明顯減少，綜合兩組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):芍藥苷在0.25～5 mg/L濃度內(nèi)可減少P21mRNA的表達(dá)量，降低UVB所致HaCaT細(xì)胞的凋亡率。我們推測芍藥苷的抗凋亡作用可能與降低 UVB所致P21mRNA的表達(dá)有關(guān)。以往的相關(guān)研究表明，芍藥苷對(duì)氧化損傷具有保護(hù)作用。張洪英等［11］通過研究證實(shí)，白芍總苷（芍藥苷為白芍總苷的主要有效成分）在低濃度（0.5 mg/L和2.5 mg/L）時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞增值有促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論與此相類似。據(jù)此我們推測，芍藥苷在低濃度時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其光防護(hù)作用。

綜上所述，我們認(rèn)為芍藥苷在一定濃度范圍內(nèi)（0.25～5 mg/L）對(duì)UVB致HaCaT凋亡有防護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低HaCaT細(xì)胞P21mRNA的表達(dá)水平有關(guān)。

［1］黃綿慶，楊照新，姚茂忠，等.葛根素對(duì)中波紫外線損傷HaCaT細(xì)胞的抗氧化作用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（19）: 1915.

［2］Borlon C，Debacq-Chainiaux F，Hinrichs C，et al.The gene expression profile of psoralen plus UVA-induced premature senescence in skin fibroblasts resembles a combined DNA-damage and stress-induced cellular senescence response phenotype［J］.Exp Gerontol，2007，42（9）:911-923.

［3］Romanov VS，Pospelov VA，Pospelova TV，et al.Cyclindependent kinase inhibitor p21（Waf1）:contemporary view on its role in senescence and oncogenesis［J］.Biochemistry（Mosc），2012，77（6）:575-584.

［4］Lei X，Liu B，Han W，et al.UVB-Induced p21 degradation promotes apoptosis of human keratinocytes［J］.Photochem Photobiol Sci，2010，9（12）:1640-1648.

［5］王辰允，洪倩，馬增春，等.芍藥苷對(duì)輻射內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用的機(jī)制［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（3）:198-202.

［6］Li CR，Zhou Z，Zhu D，et al.Protective effect of paeoniflorin on irradiation-induced cell damage involved in modulation of reactive oxygen species and the mitogen-activated protein kinases［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39（2）:426-438.

［7］Tsatsou F，Trakatelli M，Patsatsi A，et al.Extrinsic aging: UV-mediated skin carcinogenesis［J］.Dermatoendocrinol，2012，4（3）:285-297.

［8］D′Orazio J，Jarrett S，Amaro-Ortiz A，et al.UV radiation and the skin［J］.Int J Mol Sci，2013，14（6）:12222-12248.

［9］卞彩云，蔣獻(xiàn).紫外線輻射誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的機(jī)制［J］.國際皮膚性病學(xué)雜志，2006，32（6）:374-376.

［10］Kobielak A，F(xiàn)uchs E.Links between alpha-catenin，NF-kappaB，and squamous cell carcinoma in skin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（7）:2322-2327.

［11］張洪英，史同新，李春陽.白芍總苷對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子和白介素-23表達(dá)的影響［J］.中華皮膚科雜志，2011，44（5）:343-346.

（收稿:2015-09-11 修回:2015-10-09）

Protective effects of Paeoniflorin on HaCaT cell aPoPtosis induced by UVB

YANG Xiuhua，CHEN Hongquan.

Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China Corresponding author:CHEN Hongquan，E-mail:chhq6198@163.com

Objective:To determine the protective effects of paeoniflorin on HaCaT cells apoptosis induced by UVB.Methods:HaCaT cells were divided into eight groups（from group A to group H）.HaCaT cells in group A was used as control.Those in group B were treated with UVB irradiation only and those in group C-H were treated with different dose（0.25 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L and 10 mg/L）of paeoniflorin and UVB.The apoptosis was detected by the flow cytometry assay.The expression level of P21mRNA was detected by RT-PCR.Results:The apoptosis rate of HaCaT cells in group B was 4.840±0.836，which was higher than those in group C-G（0.423±0.179，1.127±0.535，1.633±0.417，2.570±0.439，3.137± 0.347，respectively）（P＜0.05）.There was no significant difference in the apoptosis rate of HaCaT cells between group B and group H（P＞0.05）.The expression of P21mRNA in the group B was 1.040±0.007，which was higher than those in group C-H（0.440±0.015，0.551±0.013，0.857±0.017，0.848±0.027，0.850± 0.052，0.923±0.035，respectively）（P＜0.05）.Conclusion:Paeoniflorin has a protective effect on the apoptosis of HaCaT cells induced by UVB，and reduces the expression of P21mRNA of HaCaT cells at a certain concentration（0.25-5 mg/L）.

paeoniflorin；UVB；HaCaT cell

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào):2011-219）

青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，青島，266003

陳宏泉，E-mail:chhq6198@163.com