芍藥苷對UVB所致HaCaT細胞凋亡的防護作用

楊秀華　陳宏泉

論 著

芍藥苷對UVB所致HaCaT細胞凋亡的防護作用

楊秀華陳宏泉

目的： 明確芍藥苷對UVB所致HaCaT細胞凋亡的防護作用。方法： 將HaCaT細胞分為8組，A組:空白對照組；B組:UVB照射對照組；C～H組分別為0.25 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L及10 mg/L芍藥苷預處理組，均照射UVB。用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，RT-PCR檢測P21mRNA的表達水平。結果： B組細胞凋亡率為4.840±0.836明顯高于C～G組（0.423±0.179、1.127 ±0.535、1.633±0.417、2.570±0.439、3.137±0.347）（P＜0.05）。B組與H組（4.203±0.655）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；B組P21mRNA表達為1.040±0.007明顯高于C～H組（0.440±0.015、0.551±0.013、0.857±0.017、0.848±0.027、0.850±0.052、0.923±0.035）（P＜0.05）。結論： 芍藥苷在一定濃度內（0.25～5 mg/L）對UVB致HaCaT細胞的凋亡有保護作用，并能減少P21mRNA的表達。

芍藥苷； 中波紫外線； HaCaT細胞

中波紫外線（UVB）是引起皮膚光損傷的主要因素［1］，可引起細胞DNA損傷、氧化應激、細胞凋亡，從而導致皮膚光損傷。光損傷時光產物本身及經典的DNA雙鏈的斷裂（DSB）均可通過活化分子警察P53，激活下游信號蛋白P21等細胞周期激酶抑制劑［2］。P21作為P53基因下游的細胞周期調控因子，在細胞周期、DNA修復及細胞凋亡方面起著重要作用［3，4］。

研究發現芍藥苷具有清除組織細胞內自由基、抗氧化損傷等特點［5］，還具有保護損傷細胞、抑制細胞凋亡［6］等作用。HaCaT細胞的生物學特征與正常人角質形成細胞相似，本項研究采用UVB照射HaCaT細胞以建立細胞凋亡模型，以芍藥苷為光防護劑，檢測芍藥苷對UVB所致HaCaT細胞光損傷過程中細胞凋亡、P21mRNA表達的影響，以探討芍藥苷的光防護作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器 95%芍藥苷由寧波立華制藥惠贈，HaCaT細胞株由韓國延世大學丁擘曉博士授權，青島大學醫學院王春波教授惠贈，UVB型紫外輻照計購自北京師范大學光電儀器廠。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 將HaCaT細胞分為8組。A組:空白對照組，不加芍藥苷，不照射UVB；B組:UVB照射組，不加芍藥苷；C組:0.25 mg/L芍藥苷組；D組:0.5 mg/L芍藥苷組；E組:1 mg/L芍藥苷組；F組:2.5 mg/ L芍藥苷組；G組:5 mg/L芍藥苷組；H組:10 mg/L芍藥苷組；C～H組均照射UVB。

1.2.2HaCaT細胞培養 HaCaT細胞用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM-1640培養基，在37℃、體積分數為5%CO2的細胞培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于試驗。

1.2.3照射方法 待HaCaT細胞貼壁生長至80%左右融合時，從細胞培養箱中取出，無菌條件下加入不同濃度芍藥苷。空白對照組和照射對照組只加角質形成細胞專用培養基使各孔的終體積相等。細胞放入37℃、體積分數為5%CO2細胞培養箱中孵育24 h后，除空白對照組外，其余組均照射UVB，照射劑量為20 mJ/cm2，照射垂直距離為10 cm。

1.2.4細胞凋亡檢測 細胞經不同濃度芍藥苷處理UVB照射18 h后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。用PBS洗滌，離心收集細胞（1000 r/min，5 min），棄上清，用緩沖液重新懸浮細胞，細胞計數后將濃度調整到1×106個/mL，按照Annenxin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作規程檢測細胞凋亡率。用專用Cell Quest軟件將所得數據采進行收集、儲存和分析各組HaCaT細胞的凋亡率。

1.2.5P21mRNA表達量 細胞經不同濃度芍藥苷處理并接受 UVB照射18 h后，用RT-PCR法檢測P21mRNA表達量，凝膠成像系統分析目的條帶P21/ GAPDH的灰度比值并進行統計分析。P21及GAPDH引物序列、反應條件、擴增產物分子量見表1。

1.3統計學方法 應用SPSS 17.0軟件，實驗結果表示為ˉx±s，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用小樣本LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1芍藥苷對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率的影響 芍藥苷對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率的影響分析見圖1表2。C～G組的HaCaT細胞凋亡率明顯低于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；各實驗組間，C～E組間的凋亡率較F～H組低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1　內參和GAPDH P21的引物序列

圖1　1a～h:A～H組HaCaT細胞凋亡結果

2.2芍藥苷對UVB照射后HaCaT細胞P21mRNA表達的影響 各組均有P21mRNA的表達，GAPDH對照均出現明顯擴增條帶，表明各組細胞中RNA的質量及RT-PCR過程均良好，各組P21/GAPDH相對表達量見圖2表2。B組HaCaT細胞P21mRNA表達量最高，與B組比較各實驗組HaCaT細胞P21mRNA表達量明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表2　芍藥苷對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率及P21mRNA表達量的影響

表2　芍藥苷對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率及P21mRNA表達量的影響

組別　　凋亡率（%）　P21mRNA表達量A組　0.047±0.015　0.584±0.023 B組　4.840±0.836　1.040±0.007 C組　0.423±0.179　0.440±0.015 D組　1.127±0.535　0.551±0.013 E組　1.633±0.417　0.857±0.017 F組　2.570±0.439　0.848±0.027 G組　3.137±0.347　0.850±0.052 H組　4.203±0.655　0.923±0.035

圖2　a:GAPDH在各組的表達；b:P21mRNA在各組的表達

3　討論

近年來，由于大氣中的臭氧層破壞，致地球表面UVB輻射強度逐年增加，UVB可引起DNA損傷、氧化應激、免疫抑制、細胞凋亡等［7，8］。因此對UVB的防護成為人們關注的重要課題。細胞周期是在周期調控因子（p21、p53等）調節下進行的嚴密有序的過程，分為S期（DNA合成期）、M期（有絲分裂期）以及把S期、M期分開的G1期（DNA合成前期）、G2期（DNA合成后期）。當表皮細胞受到UVB刺激時發生DNA突變，p53基因首先被激活，p53蛋白表達增加，活化細胞周期蛋白激酶抑制物p21的轉錄，抑制周期蛋白激酶的活性，使細胞周期停滯于G1期，以便修復受損DNA［9］。有學者認為細胞周期阻滯是一種細胞自我保護性的機制［10］。

本實驗結果顯示，與空白對照組比較，照射對照組 HaCaT細胞凋亡率明顯增加，HaCaT細胞P21mRNA表達量明顯增加，表明UVB照射HaCaT細胞后可致細胞凋亡率、P21mRNA表達量增加。相對于照射對照組，C～G組細胞凋亡率明顯減少，C～H組P21mRNA表達明顯減少，綜合兩組數據發現:芍藥苷在0.25～5 mg/L濃度內可減少P21mRNA的表達量，降低UVB所致HaCaT細胞的凋亡率。我們推測芍藥苷的抗凋亡作用可能與降低 UVB所致P21mRNA的表達有關。以往的相關研究表明，芍藥苷對氧化損傷具有保護作用。張洪英等［11］通過研究證實，白芍總苷（芍藥苷為白芍總苷的主要有效成分）在低濃度（0.5 mg/L和2.5 mg/L）時對HaCaT細胞增值有促進作用，本實驗的結論與此相類似。據此我們推測，芍藥苷在低濃度時可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，發揮其光防護作用。

綜上所述，我們認為芍藥苷在一定濃度范圍內（0.25～5 mg/L）對UVB致HaCaT凋亡有防護作用，其作用機制可能與降低HaCaT細胞P21mRNA的表達水平有關。

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（收稿:2015-09-11 修回:2015-10-09）

Protective effects of Paeoniflorin on HaCaT cell aPoPtosis induced by UVB

YANG Xiuhua，CHEN Hongquan.

Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China Corresponding author:CHEN Hongquan，E-mail:chhq6198@163.com

Objective:To determine the protective effects of paeoniflorin on HaCaT cells apoptosis induced by UVB.Methods:HaCaT cells were divided into eight groups（from group A to group H）.HaCaT cells in group A was used as control.Those in group B were treated with UVB irradiation only and those in group C-H were treated with different dose（0.25 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L and 10 mg/L）of paeoniflorin and UVB.The apoptosis was detected by the flow cytometry assay.The expression level of P21mRNA was detected by RT-PCR.Results:The apoptosis rate of HaCaT cells in group B was 4.840±0.836，which was higher than those in group C-G（0.423±0.179，1.127±0.535，1.633±0.417，2.570±0.439，3.137± 0.347，respectively）（P＜0.05）.There was no significant difference in the apoptosis rate of HaCaT cells between group B and group H（P＞0.05）.The expression of P21mRNA in the group B was 1.040±0.007，which was higher than those in group C-H（0.440±0.015，0.551±0.013，0.857±0.017，0.848±0.027，0.850± 0.052，0.923±0.035，respectively）（P＜0.05）.Conclusion:Paeoniflorin has a protective effect on the apoptosis of HaCaT cells induced by UVB，and reduces the expression of P21mRNA of HaCaT cells at a certain concentration（0.25-5 mg/L）.

paeoniflorin；UVB；HaCaT cell

山東省中醫藥科技發展計劃項目（編號:2011-219）

青島大學附屬醫院皮膚科，青島，266003

陳宏泉，E-mail:chhq6198@163.com