TOX與Notch1在MF中的表達

趙　晶　張福仁　王建文　陳聲利　周桂芝　劉永霞　陳學超　盧憲梅

TOX與Notch1在MF中的表達

趙晶1，2張福仁2王建文2陳聲利2周桂芝2劉永霞2陳學超2盧憲梅2

目的： 檢測TOX蛋白及活化型Notch1蛋白在MF中的表達，探討TOX及Notch1蛋白作為MF分子標記物的可行性。方法： 采用免疫組化方法檢測35例MF（15例斑片期，10例斑塊期，10例腫瘤期）和45例對照組（15例淋巴瘤樣丘疹病、15例扁平苔蘚、15例銀屑病）的病理組織標本中TOX蛋白及活化型Notch1蛋白的表達。結果： TOX蛋白染色結果:MF陽性率約94.3%，且陰性標本全部為斑片期，對照組陽性率75.6%。MF組TOX蛋白表達強度高于對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。MF組與對照組所有病例腫瘤細胞Notch1陰性。結論： MF組與對照組TOX蛋白表達水平有顯著性差異，但還不足以證明TOX可作為診斷MF的分子標記物，需進一步驗證。Notch1蛋白不在皮膚T細胞淋巴瘤中表達，故無法作為MF的分子標記物。

皮膚T細胞淋巴瘤； 蕈樣肉芽腫； TOX； Notch信號通路； Notch1

蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）是原發性皮膚淋巴瘤中最常見的類型。早期 MF（early mycosis fungoides，eMF）的診斷至今仍是皮膚科的一個難題，其臨床及病理表現常常類似于良性炎癥性皮膚病，而且缺乏特異的分子標記物。

2012年首次提出TOX（thymocyte selection-associated high mobility group box）基因，即胸腺細胞選擇相關高遷移率族基因，可以作為 MF的分子標記物［1］。TOX在 MF進程中所起的作用也有相關研究［2，3］。此后又有一些學者對TOX在MF中的表達進行了不同的試驗及驗證，但是樣本量及對照樣本種類都有所限制，故本實驗擴大實驗組與對照組的樣本量進行進一步的驗證研究，以期發現TOX在MF各階段以及其它皮膚疾病中的表達是否有顯著性差異。國內劉潔團隊采用免疫組化、RNA提取及RT-PCR、Western blot、細胞培養及轉染、細胞遷移及入侵檢測等技術，最終提出TOX在MF皮損中高表達，且與MF的增殖及轉移相關，TOX是MF的一個診斷標記，并在疾病進展過程中具有病因學作用［2］。

Notch信號通路無第二信使，是一種構造比較簡單的通路，迄今為止，已經有不少學者證實Notch通路與很多腫瘤的發生發展有重要關系，至今發現的Notch受體有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，而其中在腫瘤組織中Notch1受體通路異常報道最多。有研究表明，Notch1在淋巴細胞發育過程中發揮著重要作用，而且已有學者證實Notch1在T細胞淋巴瘤中的異常表達，但是至今沒有在皮膚T細胞淋巴瘤中的相關研究［4，5］，故本研究主要針對皮膚T細胞淋巴瘤中最常見的MF，進行Notch1蛋白表達的檢測，分析活化型Notch1（NICD）在MF中的表達是否有特異性。

1　資料與方法

1.1研究對象 MF組及對照組均來自我院2011-2015年的病例，共80例，其中MF組患者35例（斑片期15例，斑塊期10例，腫瘤期10例），對照組包括淋巴瘤樣丘疹病15例、扁平苔癬15例、尋常型銀屑病15例。所有病理標本蠟塊均來自于我院病理科。

1.2主要儀器及試劑 主要儀器包括:徠卡公司切片機RM2235、全自動染色機ST5020、全自動免疫組化機BOND-MAX、封片機CV5030，湖北康強醫療器械公司攤片烤片機TKD-TK。一抗:兔抗人多克隆TOX抗體，購自SIGAM公司；兔抗人多克隆Notch1抗體，Notch胞內段（NICD），購自MILLIPORE公司。二抗:二抗試劑盒，購自徠卡公司自動免疫組化機配套試劑盒。

1.3實驗方法

1.3.1預實驗 分別將TOX抗體及活化型Notch1抗體稀釋不同濃度（1∶500，1∶300，1∶200，1∶100，1∶50），觀察染色效果，找到最適稀釋濃度。最終確定TOX及Notch1最適稀釋度均為1∶100。

1.3.2免疫組化檢測TOX及Notch1在實驗組及對照組的表達 組織蠟塊切片機切片，攤片，并置于75℃烤片機上烤30 min。將切片置于全自動染色機中脫蠟，順序依次為:二甲苯A 5 min，二甲苯B 5 min，無水乙醇A 5 min，無水乙醇B 5 min，95%乙醇1 min，85%乙醇1 min，75%乙醇1 min，自來水2 min。

在全自動免疫組化機系統中添加病例，每個編號添加TOX及Notch1兩個玻片，并打印粘貼標簽。將玻片依次放在卡槽上，按標識將干凈的蓋板放置在玻片上，所有玻片放置完畢后，將玻片架保持水平輕輕推入儀器中，點擊裝載/卸載按鈕。

將TOX/Notch1抗體與稀釋液按1∶100稀釋度注入試劑瓶掃描條碼并錄入抗體信息。將一抗及二抗試劑盒置于試劑架上，系統自行檢查玻片、試劑、儀器均正常后，點擊運行按鈕。機器開始運行。染色結束后，取下玻片架及蓋板，并清洗蓋板。將染色完成的玻片置于全自動染色機中脫水。脫水完成后切片放入自動封片機封片。

1.4病理科醫師閱片、評分 每個切片由兩名皮膚病理專業醫師閱片，評分由陽性細胞計數以及染色強度共同決定。

結果判定標準:40×10視野隨機觀察10個視野，各計數100個細胞，陰性為0分，1～25%為1分，26～50%為2分，51～75%為3分，76～100%為4分。

染色強度標準:不著色為0分，淺棕黃為1分，金黃/棕黃為2分，棕褐色為3分。

蛋白表達水平由計數×染色強度，0分為-，1～3分為+，4～6分為++，7～9分為+++，10～12分為++++。

2　結果

免疫組化結果（MF均顯示分期，LyP:淋巴瘤樣丘疹病，LP:扁平苔蘚，診斷均經過2位病理科醫師確診）結果均按照蛋白表達水平顯示（蛋白表達水平=計數×染色強度）。

2.1TOX蛋白染色結果 實驗組:35例MF中有33例TOX陽性，2例陰性，且2例陰性全部為斑片期；15例斑片期MF中2例陰性，10例+，3例++；10例斑塊期中6例+，2例++，2例+++；10例腫瘤期中4例+，4例++，2例++++（圖1，圖2）。對照組:15例淋巴瘤樣丘疹病中6例陰性，8例+，1例++；15例銀屑病中5例陰性，8例+，2例++；15例扁平苔癬13例+，2例++（圖3）。

2.2活化型Notch1蛋白染色結果 所有病例中僅有4例表達陽性（+），且均表現為中性粒細胞陽性，并非是腫瘤細胞。4例分別為1例MF腫瘤期，2例淋巴瘤樣丘疹病，1例銀屑病（圖4）。

對TOX蛋白表達強度采用Fisher’s exct test，MF組與對照組比較（MF組陰性表達2例，陽性33例；對照組陰性表達11例，陽性34例），P=0.0074（P＜0.05），差異有統計學意義（所有數據經SPSS 17.0進行統計和處理）。

圖1　腫瘤期MF標本中TOX蛋白的表達

圖2　斑片期MF標本中TOX蛋白的表達

圖3　對照組中TOX蛋白的表達

圖4　4a活化型Notch1蛋白在汗腺表達陽性（×200）；4b活化型Notch1蛋白在中性粒細胞表達陽性（×200）；4c活化型Notch1蛋白在MF腫瘤細胞中不表達（×200）

3　討論

皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）是一種表現在皮膚的一種特殊類型的T細胞淋巴瘤，早期的CTCL在臨床與組織病理表現上與良性炎癥性皮膚病很難區分，早期診斷比較困難［7］，這其中又以eMF為研究熱點。

eMF（斑片期及早期斑塊期）診斷困難主要是因為缺乏特異性細胞及分子標記物。Zhang等采用高通量基因組轉錄分析篩選出349個基因，在eMF與正常皮膚中存在差異性表達，后又在其中發現只有19個基因是在eMF中特異表達，在炎癥性皮膚病中無特異性［1］。其中TOX和PDCD1，在RNA表達上與炎癥性皮膚病比較有明顯不同，而且對eMF皮損行免疫組化及免疫熒光染色MF細胞以及Pautrier’s微膿腫中均有TOX特異性染色表現，于是進而提出TOX可作為MF分子標記物［1］。2014年其團隊又進一步對113例MF標本進行了TOX表達水平的檢測，最終發現TOX mRNA的表達水平顯著增高于慢性炎癥性疾病及正常皮膚組織，且MF斑塊期、腫瘤期的表達水平高于斑片期。另外指出TOX的表達水平與疾病進程及預后有相關性，從而提出TOX mRNA的表達可作為對MF診斷及預后有用的一個標記［8］。

隨后，Morimura等提出TOX是否可以作為不同亞型皮膚淋巴瘤腫瘤細胞的標記物。他們采用免疫組化方法檢測了TOX在MF（斑片期、斑塊期、腫瘤期）、SS、淋巴瘤樣丘疹病（LyP）、間變性大細胞型原發性皮膚淋巴瘤（PCALCL）、成人 T細胞淋巴瘤（ATLL）、外周T細胞淋巴瘤（PTCL）以及未分類型（NOS），同時檢測了特應性皮炎（AD）及正常皮膚組織作為對照組。另外檢測了MF/SS的mRNA表達水平。免疫組化結果顯示TOX在MF、SS、PTCL、NOS中高表達（明顯的核著色），在LyP、PCALCL、ATLL中顯示核輕微著色。TOX mRNA在SS中的表達高于在MF中的表達。由此提出結論:TOX可能成為某些特定類型的皮膚淋巴瘤的腫瘤細胞的特殊標記物［7］。

本研究主要從蛋白表達水平來探究TOX能否作為MF的特異性分子標記物，結果顯示MF組與對照組均有陽性表達，在MF中，隨病程進展，表達增強（斑片期最高強度為++，斑塊期為+++，腫瘤期為++++），且陰性標本均為斑片期。作為一種低度惡性的T細胞淋巴瘤，淋巴瘤樣丘疹病也有TOX表達，但蛋白表達強度較MF低。銀屑病及扁平苔癬作為炎癥性皮膚病，均有表達，蛋白表達強度較MF低。統計學結果顯示MF與對照組蛋白表達水平有顯著性差異，但若把TOX作為診斷MF的分子標記物，或者早期MF與炎癥性皮膚病的鑒別診斷標記物，本實驗結果還不足以提供可靠證據，可能還需進一步驗證。

Notch信號通路被證實與很多腫瘤的發生發展有關，在卵巢癌、肝癌、腎細胞癌等腫瘤中均發現過Notch的異常表達。Notch蛋白影響調控了血液及淋巴系統的部分功能，有學者發現哺乳動物中Notch1在胸腺中高表達，且在成人T細胞淋巴瘤中有突變的發生，并驗證了Notch1在T細胞的分化階段中起一定作用［4，9，10］。Notch1基因編碼的Notch1蛋白是一種跨膜的蛋白受體，分為胞外段、跨膜區及胞內段三部分，其中胞內段即為 NICD。近年有很多學者對Notch1通路與成人T細胞白血病之間的關系進行了多方面的研究，有實驗證實了在急性T細胞白血病中Notch1基因有突變，后來相繼對其他T細胞淋巴瘤中的Notch1表達做了研究，發現有異常表達。

以上研究均針對血液系統T細胞淋巴瘤，并沒有對皮膚T細胞淋巴瘤的相關研究［5，11-13］。我們的研究結果顯示MF組及對照組均未發現表達Notch1蛋白的T細胞，僅有4例中性粒細胞表達Notch1。故本實驗中Notch1蛋白并不在皮膚T細胞淋巴瘤中表達，推測Notch信號通路可能不參與MF的發病機制，進一步結論還需更深入的實驗研究。

［1］Zhang Y，Wang Y，Yu R，et al.Molecular markers of earlystage mycosis fungoides［J］.J Invest Dermatol，2012，132（6）:1698-706.

［2］Yu X，Luo Y，Liu J，et al.TOX acts an oncological role in mycosis fungoides［J］.PLoS One，2015，10（3）:e0117479.

［3］Litvinov IV，Netchiporouk E，Cordeiro B，et al.The Use of Transcriptional Profiling to Improve Personalized Diagnosis and Management of Cutaneous T-cell Lymphoma（CTCL）［J］.Clin Cancer Res，2015，21（12）:2820-2829.

［4］Kuksin CA，Minter LM.The link between autoimmunity and lymphoma:does NOTCH signaling play a contributing role？［J］.Front Oncol，2015，5:51.

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［7］Morimura S，Sugaya M，Suga H，et al.TOX expression in different subtypes of cutaneous lymphoma［J］.Arch Dermatol Res，2014，306（9）:843-849.

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（收稿:2016-01-19 修回:2016-01-20）

TOX and Notch1 exPression in mycosis fungoides

ZHAO Jing1，2，ZHANG Furen2，WANG Jianwen2，CHEN Shengli2，ZHOU Guizhi2，LIU Yongxia2，CHEN Xuechao2，LU Xianmei2.

1.School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China；2.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，Jinan 250022，China Corresponding author:LU Xianmei，E-mail:xinmeilu2013@163.com

Objective:To detect the expression of TOX and Notch1 protein for mycosis fungoides（MF）and to determine the role as a potential molecular markers for MF.Methods:TOX and Notch1 protein were detected by immunohistochemical staining in the lesions of 35 patients with MF（15 patients at patch stage，10 at plaque stage and 10 at tumour stage）and in 45 controls（15 patients with lymphomatoid papulosis，15 with lichen planus and 15 with psoriasis）.Results:The positivity rate of TOX in the patients with MF was 94.3% and 76%in controls.The level of TOX protein expression was higher in MF patients than in controls（P＜0.05）.Notch1 protein was negative in tumor cells of all MF patients and controls.Conclusion:Although TOX expression level was higher in MF patients，TOX protein can not be used as a potential molecular marker for MF and further experimental studies should be performed.Notch1 protein is not a molecular marker for MF.

cutaneous T-cell lymphomas；MF；TOX；Notch signaling pathways；Notch1

1濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南，250000
2山東省皮膚病性病防治研究所，濟南，250022

盧憲梅，E-mail:xinmeilu2013@163.com

因早期MF（eMF）臨床及病理表現與良性炎癥性皮膚病常常難以鑒別，故本實驗選擇具有典型病理表現的扁平苔蘚及銀屑病作為對照組；淋巴瘤樣丘疹病（LyP）與MF很難區分［6］，為了比較廣泛的驗證TOX及Notch1是否是MF特異性的分子標記物，故也把淋巴瘤樣丘疹病作為對照組。