散結鎮痛膠囊對PGF2α誘發小鼠子宮平滑肌細胞收縮的抑制作用探討

劉莉娜，呂耀中，孫　蘭，周　軍，王振中，蕭　偉（1.江蘇康緣藥業股份有限公司，2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇連云港　222001）

散結鎮痛膠囊對PGF2α誘發小鼠子宮平滑肌細胞收縮的抑制作用探討

劉莉娜1，2，呂耀中1，2，孫蘭1，2，周軍1，2，王振中1，2，蕭偉1，2
（1.江蘇康緣藥業股份有限公司，2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇連云港222001）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.054.html

目的研究散結鎮痛膠囊對前列腺素F2α致原代小鼠子宮平滑肌細胞收縮變化的影響，初步探討其對痛經的治療作用。原代培養小鼠子宮平滑肌細胞并進行純度鑒定，給藥后監測動態鈣離子變化，染色法觀察細胞收縮的情況，免疫熒光法測定細胞鈣調蛋白（calmodulin，CaM）、肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）、磷酸化的肌球蛋白輕鏈2（phosphorylation of myosin light chain 2，p-MLC20）的蛋白表達水平。結果平滑肌肌動蛋白免疫熒光染色呈強陽性。與PGF2α組比較，散結鎮痛膠囊組的鈣離子熒光值明顯降低（P≤0.05）；細胞面積明顯增加（P≤0.01）；CaM的蛋白表達水平明顯降低（P≤0.05）；MLCK的蛋白水平有下調趨勢；p-MLC20的蛋白表達水平明顯降低（P≤0.01）。結論散結鎮痛膠囊能治療痛經，可能與其能抑制平滑肌細胞內鈣離子內流，緩解細胞的收縮，降低CaM，p-MLC20的蛋白表達水平有關。

原代小鼠子宮平滑肌細胞；鈣離子；細胞收縮；前列腺素F2α；CaM；p-MLC20

痛經是目前婦科最常見的疾病，嚴重影響了婦女的正常工作和生活質量。研究表明，痛經與PGF2α的水平直接相關［1］，臨床多用非甾體抗炎藥來治療痛經，但是在肝、腎、消化系統方面往往出現副作用。因此，用中藥治療痛經是一個不錯的選擇［2］。

散結鎮痛膠囊組成為龍血竭、三七、浙貝母、薏苡仁，具有軟堅散結，化瘀定痛的功效。本實驗利用原代培養的小鼠子宮平滑肌細胞，建立PGF2α致其收縮模型來考察散結鎮痛膠囊對原代小鼠子宮平滑肌細胞收縮的變化影響，為探討其治療痛經的機制提供依據。

1　材料

1.1儀器與設備超凈工作臺（蘇凈安泰，SW-CJ-2F型），二氧化碳培養箱（Thermo scientific 3100），倒置顯微鏡（OLYPUS，CKX41SF），黑色底透96孔細胞培養板（美國Costar），細胞培養瓶（美國Costar），移液槍（Eppendorf），高壓蒸汽滅菌鍋（BXM-30R立式壓力蒸氣滅菌鍋），離心機（北京眾益中和生物技術有限公司，LD4-2A），細胞自動計數儀（Invitrogen，c1028），倒置熒光顯微鏡（DMI4000B），高內涵檢測儀（ArrayScanⅦ），Flexstation?3鈣流工作站（MD）。

1.2材料與試劑DMEM/F12培養基、膠原酶Ⅱ（Gibco），胎牛血清（Hyclone），胰蛋白酶、EDTA、多聚甲醛（AMRESCO），青霉素/鏈霉素混合液（Biotopped），平滑肌肌動蛋白（anti-α-actin）、CaM、MLCK（Abcam），p-MLC20、Alexa Fluor?488 Conjugate、DRAQ5?（CST），羊血清（武漢柏世德），Hoechst 33258、前列腺素 F2α（Sigma），Calcium 6-QF Assay Kit（MD），苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業股份有限公司），Triton X-100（生工生物），HCS CellMask Deep Red stain（life）。

1.3動物♀ICR小鼠，7～8周齡，購于揚州大學比較醫學中心，SCXK（蘇）2012-0004。

2　方法

2.1樣品的制備用DMSO溶解，配制成濃度為12.5 g·L-1的母液。

2.2小鼠子宮平滑肌細胞的原代培養與鑒定［3-4］

ICR♀小鼠注射苯甲酸雌二醇注射液2 d（每只注射0.1 mg）。ICR♀小鼠脫頸處死，75%酒精消毒，取出子宮置于新添入雙抗的PBS中。剝離脂肪、結締組織，縱向剪開子宮，手術刀輕輕刮除子宮內膜，PBS沖洗1～2遍。棄去緩沖液，眼科剪將肌條剪成1～2 mm3碎糜，加入2 mL 0.025 g·L-1的膠原酶Ⅱ轉移入錐形瓶，5 mL膠原酶Ⅱ清洗剪刀。移錐形瓶于37℃水浴鍋消化1 h，隔0.5 h巴氏吸管吹打5 min。等體積含15%血清的完全培養基停止消化，200目細胞篩過濾，濾液1 000 r·min-1×10 min離心，棄上清，完全培養基混懸細胞，接種入25 cm2細胞瓶培養。

隔2 d，PBS清洗2遍，棄去死細胞和雜質，加入完全培養基，于37℃、5%CO2細胞培養箱繼續培養。細胞培養至d 5，棄上清，加入2 mL 0.025 g· L-1胰蛋白酶+0.002 g·L-1EDTA消化5 min，等體積完全培養基停止消化，1 000 r·min-1×3 min離心，棄上清，加入完全培養基，混懸細胞，接種于96孔板。于37℃、5%CO2細胞培養箱培養過夜。棄上清，PBS洗1遍，0.4 g·L-1多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，用封閉液5%山羊血清/0.3% Triton X-100封閉1 h。加入平滑肌肌動蛋白（antiα-actin）一抗（1∶300），4℃過夜。次日平衡至室溫，Alexa Fluor?488 Conjugate（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，Hoechst 33258（2 μg·L-1）復染10 min，PBS清洗1遍，倒置熒光顯微鏡拍攝，以胞質出現亮綠色為陽性結果，同時計算陽性百分率。陰性對照不加一抗，只加抗體稀釋液。鏡下劃分4個區域，數藍色細胞核，利用顯綠色的細胞總數%4個區域的染核細胞數，得到陽性百分率。

2.3鈣離子檢測細胞傳代，以1×108·L-1密度種板于黑色96孔板，于37℃、5%CO2細胞培養箱培養過夜。棄上清，加入100 μL Calcium 6-QF溶液，37℃孵育2 h。按需要分為空白組、模型組和給藥組。空白組和模型組加入50 μL的PBS，給藥組加入PBS配制的散結鎮痛膠囊溶液（終濃度為12.5 g·L-1）50 μL，作用15 min。Flexstation?3鈣流工作站檢測動態鈣離子變化：儀器設置成運行20 s后空白組加入50 μL PBS，其余各組加入PGF2α（終濃度為420 nmol·L-1）50 μL，測定100 s內鈣離子的變化。

2.4細胞收縮檢測［5］細胞傳代，以3×107·L-1密度種板于黑色96孔板，于37℃、5%CO2細胞培養箱培養過夜。按需要分為空白組、模型組和給藥組。空白組和模型組加入無血清培養基100 μL，給藥組加入無血清培養基配制的散結鎮痛膠囊溶液（終濃度為12.5 g·L-1）100 μL，作用1 h。棄上清，空白組加入無血清培養基100 μL，模型組和給藥組加入PGF2α（終濃度為420 nmol·L-1）100 μL作用1 h。棄上清，0.4 g·L-1多聚甲醛固定，室溫孵育15 min，棄上清，PBS洗板3次。加入0.1% Triton X-100溶液100 μL，室溫孵育15 min，棄上清，PBS洗板3次。加入100 μL HCS CellMask Deep Red stain，室溫孵育30 min，棄上清，PBS洗板3次，高內涵儀器檢測成像。

2.5蛋白表達水平的檢測細胞傳代，以4×107·L-1密度種板于黑色96孔板，于37℃、5%CO2細胞培養箱培養過夜。按需要分為空白組、模型組和給藥組。空白組和模型組加入無血清培養基100 μL，給藥組加入無血清培養基配制的散結鎮痛膠囊溶液（終濃度為12.5 g·L-1）100 μL，作用1 h。棄上清，空白組加入無血清培養基100 μL，模型組和給藥組加入PGF2α（終濃度為420 nmol·L-1）100 μL作用1 h。棄上清，0.4 g·L-1多聚甲醛固定15 min，PBS洗5 min×3次，用封閉液5%山羊血清/ 0.3%Triton X-100封閉1 h。分別加入CaM、MLCK、p-MLC20（1∶200）一抗，4℃過夜。次日平衡至室溫，Alexa Fluor?488 Conjugate（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，DRAQ5?復染5 min，PBS洗板1遍，高內涵儀器成像。

2.6統計學分析實驗結果采用SPSS 13.0軟件分析結果。組間數據應用單因素方差分析結果。

3　結果

3.1小鼠子宮平滑肌細胞的鑒定為了鑒定小鼠子宮平滑肌細胞的純度，用平滑肌細胞特異的肌動蛋白進行免疫熒光染色后，用Hoechst 33258復染。Fig 1染色結果表明：平滑肌細胞肌動蛋白存在于細胞質，綠色熒光為陽性染色，主要分布在胞質區域。細胞核在復染后呈藍色。數出細胞總數和免疫染色陽性細胞數。統計結果表明，平滑肌細胞純度在99%以上。陰性對照未呈現綠色熒光。

Fig 1　Identification of mouse myometrial smooth muscle cells

3.2鈣離子檢測藥物作用15 min后，直接上機檢測鈣離子的熒光強度，穩定20 s后，儀器直接加入相應液體，空白組20 s后的曲線因體積變化，熒光值有所增加。模型組和藥物組20 s后曲線因體積變化先升高，又因加入PGF2α，曲線降低。藥物組預給藥后，曲線回升要高一些。Fig 2結果顯示，與空白組比較，模型組差異有顯著性；與模型組比較，散結鎮痛膠囊（12.5 g·L-1）組差異有顯著性，能明顯抑制USMCs內鈣離子的內流（P≤0.05）。

3.3細胞收縮檢測預給藥散結鎮痛膠囊后進行造模1 h，Fig 3結果顯示，與空白組比較，模型組細胞面積明顯縮小；與模型組比較，散結鎮痛膠囊組明顯擴張，能明顯抑制PGF2α引起的細胞收縮（P≤0.01）。

Fig 2　Inhibitory effects of SJZT capsule on［Ca2+］iinduced by prostaglandin F2α

3.4蛋白表達水平的檢測免疫熒光結果顯示（Fig 4），與空白組比較，模型組蛋白明顯上調；與模型組比較，散結鎮痛膠囊組明顯下調，能明顯降低CaM、p-MLC20的蛋白表達水平（P≤0.05，P≤0.01），MLCK的表達有降低趨勢，差異無顯著性。

4　討論

散結鎮痛膠囊臨床上用來治療原發性痛經、子宮肌瘤、慢性盆腔炎包塊、子宮內膜異位癥等具有較好的療效，能明顯抑制PGF2α的含量［6-7］。平滑肌細胞內鈣離子主要儲存在肌漿網［8］，作為在細胞收縮中起重要作用的第二信使，刺激后可通過細胞內鈣離子的釋放和胞外的內流，引起鈣離子濃度的升高。

Fig 3　Inhibitory effects of SJZT capsule on contraction induced by prostaglandin F2α

平滑肌的收縮是通過細胞內鈣離子的濃度來調節的［9］，我們擬從平滑肌收縮角度考察散結鎮痛膠囊對原代小鼠子宮平滑肌細胞的鈣離子變化影響，以期對其治療原發性痛經等機制能有進一步的闡述。

根據文獻報道，我們簡化了原代培養小鼠子宮平滑肌細胞的分離培養方法，得到的細胞純度較高。實驗室觀察發現，原代培養的細胞至完全融合需要5～7 d，此后每隔5 d傳代1次，目前已傳代到第11代。同時我們也做了細胞凍存，與不斷傳代的細胞相比，復蘇后的細胞活力明顯要差一點，但是傳代后不影響使用，這為后續篩選散結鎮痛膠囊的有效部位提供了保證。

高內涵篩選技術在藥物研發的初篩、機制研究和安全性評價方面具有重要作用，能將藥物對活細胞的作用進行圖像采集，通過軟件進行數據分析得到實驗結果［10］。通過高內涵儀器分析讀取染色后的細胞面積，我們可以快速觀察到給藥前后細胞整體的形態變化。

原代小鼠子宮平滑肌細胞同批次提取得到的蛋白不足以進行蛋白印跡實驗，故而采用高內涵儀器進行蛋白免疫熒光實驗。當平滑肌細胞內Ca2+濃度升高，與CaM結合，激活MLCK激酶，激酶繼續催化MLC20發生磷酸化反應，構象改變，導致平滑肌收縮［11］。

Fig 4　Levels of CaM，MLCK，p-MLC20induced by prostaglandin F2α

實驗中用PGF2α刺激原代小鼠子宮平滑肌細胞，引起了CaM、MLCK、p-MLC20水平的升高，給予散結鎮痛膠囊后，蛋白均有下調，說明其確實可以抑制細胞的收縮，可能具有緩解疼痛的作用。

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Inhibitory effects of Sanjie Zhentong capsule on primary mouse myometrial cells contraction induced by prostaglandin F2α

LIU Li-na1，2，LYU Yao-zhong1，2，SUN Lan1，2，ZHOU Jun1，2，WANG Zhen-zhong1，2，XIAO Wei1，2
（1.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.，Ltd.，2.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process，Lianyungang，Jiangsu222001，China）

AimTo investigate the effects of Sanjie Zhentong capsule on cultured mouse myometrial cell contraction induced by prostaglandin F2α（PGF2α），and to elucidate the mechanism of Sanjie Zhentong capsule in treating dysmenorrheal.MethodsPrimary mouse myometrial cells were cultured and identified.Intracellular calcium（［Ca2+］i）was monitored under a Flex-Station 3 Benchtop Multi-Modo Microplate Reader using Calcium 6-QF.Myometrial cells were labeled to observe the changes of contraction.The expressions of calmodulin（CaM），myosin light chain kinase（MLCK），myosin light chain phosphorylation（p-MLC20）in mouse uterine smooth muscle cells（USMCs）were de-termined by immunofluorescence.ResultsSanjie Zhentong capsule suppressed the intracellular［Ca2+］iinflow and reduced the areas of myometrial cells induced by PGF2α.Then it significantly decreased CaM and p-MLC20levels.ConclusionOur results indicate that Sanjie Zhentong capsule has inhibitory effect on dysmenorrheal induced by PGF2α.Furthermore，its major mechanism may be related with the regulation of intracellular［Ca2+］iinflow and the levels of CaM and p-MLC20.

primary mouse smooth muscle cells；intracellular calcium；contraction；PGF2α；CaM；p-MLC20

◇研究簡報◇

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.027

A

1001-1978（2016）05-0732-05中國圖書分類號：R-332；R282.71；R322.65；R322.74；R329. 24；R711.510.531

2016-01-04，

2016-02-10

國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項（No 2011ZX09201-201-20）

劉莉娜（1984-），女，碩士，工程師，研究方向：藥理毒理學，Tel：0518-81152335，E-mail：slina126305@126.com；蕭偉（1959-），男，博士，高級工程師，研究方向：中藥新藥的研究與開發，Tel：0518-81152337，E-mail：kanionlunwen@163.com