白花丹醌對人肝癌細胞HepG2侵襲和凋亡的影響

謝金玲，趙　川，李俊萱，韋燕飛（廣西中醫藥大學基礎醫學院生理教研室，廣西南寧　530001）

白花丹醌對人肝癌細胞HepG2侵襲和凋亡的影響

謝金玲，趙川，李俊萱，韋燕飛
（廣西中醫藥大學基礎醫學院生理教研室，廣西南寧530001）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.036.html

目的探討白花丹醌對人肝癌HepG2細胞侵襲和凋亡的影響。方法人肝癌HepG2細胞進行體外培養，經不同濃度的白花丹醌處理后，MTT法檢測細胞的增殖抑制作用；Transwell細胞體外侵襲實驗觀察細胞的侵襲能力；流式細胞術Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡情況；免疫組化法檢測細胞內Bax、Bcl-2蛋白的表達水平。結果MTT結果顯示，與對照組比較，白花丹醌干預組抑制HepG2細胞增殖，并呈劑量-效應關系（P＜0.05）；Transwell細胞體外侵襲實驗顯示，隨白花丹醌用藥濃度的遞增，細胞侵襲能力明顯下降，尤其以4、8 μmol·L-1明顯（P＜0.01）；流式細胞術結果顯示，白花丹醌作用HepG2細胞48 h，4、8 μmol·L-1組細胞凋亡率均明顯高于對照組；免疫組化顯示，隨著白花丹醌濃度增加，Bax蛋白表達增強，Bcl-2蛋白表達減弱，并呈劑量依賴性（P＜0.01）。結論白花丹醌能夠抑制HepG2細

白花丹醌；人肝癌細胞HepG2；增殖；侵襲；細胞凋亡；Bax；Bcl-2

近年來研究表明，白花丹的主要活性成分白花丹醌（plumbagin）具有明顯的抗肝纖維化作用［1-3］，其抗腫瘤也被臨床實踐所驗證，是一種很有潛力且十分具有應用前景的抗腫瘤天然藥物，對人乳腺癌細胞侵襲和遷移有較好的抑制作用［4］，能夠誘導人肺癌細胞發生凋亡和自噬作用［5］。白花丹醌對人肝癌細胞HepG2的增殖有抑制作用［6］，但其抗肝癌的具體機制未明，目前報道很少。本實驗以人肝癌細胞株（HepG2）為研究對象，采用MTT法檢測白花丹醌對HepG2細胞增殖的影響，Transwell細胞體外侵襲實驗觀察HepG2細胞的侵襲能力，應用流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡的情況，免疫組化檢測白花丹醌對HepG2細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達的影響，探討白花丹醌抗肝癌的可能機制。

1　材料與儀器

1.1細胞株人肝癌細胞HepG2，購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2藥物與試劑白花丹醌（批號：SLBG3436V）購自Sigma公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，制備成0.1 mol·L-1的白花丹醌溶液，置于4℃避光保存，用時稀釋成不同濃度的工作液，DMSO在各組工作液的總濃度均低于0.1%；高糖DMEM培養基購自Hyclone公司，新生牛血清購自四季青公司；MTT試劑盒，購自Vazyme公司；鼠抗人Bax、Bcl-2單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自Santa Cruz公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自美國BD公司。

1.3主要儀器細胞培養箱（Sanyo MCO-18AIC，日本）；高速離心機（Thermo Fisher Sorvall ST 16R，美國）；酶標儀（Epoch Biotek，美國）；電熱恒溫培養箱（DNP-9162，中國）；光學顯微鏡（Olympus BX53，日本）；倒置生物顯微鏡（Leica DM2500，德國）；流式細胞儀（BD LSRFortessa，美國）。

2　方法

2.1細胞培養人肝癌細胞HepG2，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下，于10%新生牛血清的高糖DMEM培養液中培養，觀察細胞生長情況，每2～3 d傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2MTT細胞增殖抑制實驗取對數生長期的人肝癌細胞HepG2細胞進行細胞計數，調整細胞濃度為4×107·L-1，以每孔100 μL接種于96孔培養板中，設置空白孔（無細胞）、對照孔（培養基不加藥，有細胞）、實驗孔（不同濃度的白花丹醌干預），每組設定5個復孔。細胞常規培養24 h后完全貼壁，去除孔中培養液，分別加入1、2、4、8 μmol·L-1的白花丹醌工作液。干預24、48 h后，每孔加入10 μL MTT（5 g·L-1），孵育4 h，小心吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，微型混合器上水平震蕩5 min后于酶標儀上測定570 nm處的OD值。按下列公式計算不同濃度白花丹醌對HepG2細胞的增殖抑制率：抑制率（IR）/%=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。根據不同濃度的白花丹醌對細胞增殖的能力，選擇最佳作用時間（后續實驗以此作為時間條件）。

2.3Transwell體外侵襲實驗觀察細胞的侵襲能力冰上將融化后的BD Matrigel用冰高糖DMEM稀釋4倍，混勻，往預冷的Transwell板上室加稀釋后的Matrigel，每孔50 μL，均勻鋪平，并置于細胞培養箱中孵育3～4 h。消化已用無血清高糖DMEM饑餓20 h的HepG2細胞，并細胞計數，調整細胞濃度為4×108·L-1，離心棄上清液后，分別用100 μL 0.1%BSA的培養液配制的不同濃度的白花丹醌重懸細胞，加入Matrigel已成膠的Transwell上室中，下

室加入600 μL 10%新生牛血清培養液，每組設3個復孔，置于培養箱中孵育。20 h后，取出Transwell板，移去培養液，PBS清洗Transwell小室2次，4%多聚甲醛固定20 min，無水甲醛透化20 min，0.1%結晶紫染色15 min，每步均用PBS清洗2次，用棉簽輕輕拭去沒有侵襲的細胞及基質膠，封片，倒置顯微鏡下隨機取5個視野觀察、拍照并細胞計數。

2.4流式細胞術Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡情況各白花丹醌用藥組細胞嚴格按照凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。藥物與細胞共孵育48 h后，細胞消化成單個細胞懸液，離心后完全培養基清洗細胞2次，進行Annexin V、PI聯合標記，加入5 μL Annexin V，20 μL PI，混勻，以3 000 r·min-1離心5 min，洗滌后，加入500 μL完全培養基重懸細胞，隨即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.5免疫細胞化學檢測Bax、Bcl-2蛋白水平采用免疫組化SP法，將對數生長期的HepG2細胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，24 h待細胞貼壁生長后，白花丹醌分組干預。藥物與細胞共孵育48 h后，取出蓋玻片置于載玻片上，用4%多聚甲醛固定，3%H2O2消除內源性過氧化氫酶，正常血清封閉后分別加入鼠抗人Bax、Bcl-2單克隆抗體，4℃孵育過夜，隨后加入生物素二抗工作液及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，經DAB顯示，脫水、封片，光學顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照。檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。Bax、Bcl-2表達陽性的細胞，光學顯微鏡下可觀察到細胞的胞質內呈現特異性棕褐色，陽性表達率/%=（500個細胞內陽性細胞數/ 500個細胞數）×100%。

2.6統計學處理實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，各均數兩兩比較采用q檢驗。

3　結果

3.1白花丹醌對HepG2細胞增殖的影響采用不同濃度白花丹醌干預不同時間（24、48 h）后，MTT分析（Fig 1）發現，各濃度白花丹醌干預24 h對HepG2細胞的增殖無明顯抑制作用（P＞0.05），而干預48 h，白花丹醌呈劑量依賴性抑制HepG2細胞的增殖，以8 μmol·L-1濃度最為明顯，與對照組比較差異最具明顯（P＜0.01），后續實驗采用48 h干預時間。

3.2白花丹醌對HepG2細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗顯示，白花丹醌干預HepG2細胞后，細胞侵襲能力明顯減弱，白花丹醌4，8 μmol· L-1尤其明顯（P＜0.01，Fig 2，Tab 1）。

Fig 1　Effect of plumbagin on proliferation of HepG2 cells（±s，n=5）

Tab 1　Effect of plumbagin on invasion ability of HepG2 cells（±s，n=5）

Tab 1　Effect of plumbagin on invasion ability of HepG2 cells（±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group　Invasion amount　Invasion rate/% Control　194.00±6.000　/ Plumbagin 1 μmol·L-1　180.00±8.185*　92.78 Plumbagin 2 μmol·L-1　175.00±5.000*　90.21 Plumbagin 4 μmol·L-1　81.00±4.583**　41.75 Plumbagin 8 μmol·L-1　45.67±2.517**23.19

3.3流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡與對照組比較，白花丹醌4、8 μmol·L-1組凋亡最為明顯，差異均具有顯著性（P＜0.01，Fig 3，Tab 2）。

Tab 2　Effect of plumbagin on apoptosis of HepG2 cells（±s，n=3）

Tab 2　Effect of plumbagin on apoptosis of HepG2 cells（±s，n=3）

**P＜0.01 vs control group

Group　Apoptosis rate/% Control　21.200±1.054 Plumbagin 1 μmol·L-1　23.800±0.625 Plumbagin 2 μmol·L-1　28.067±0.950 Plumbagin 4 μmol·L-1　45.067±4.910**Plumbagin 8 μmol·L-1　49.367±4.884**

3.4白花丹醌對Bax、Bcl-2蛋白表達的影響不同濃度的白花丹醌作用48 h后，HepG2細胞內均出現不同程度的棕褐色顆粒物，隨著濃度增加，促凋亡基因Bax蛋白表達明顯上調，抗凋亡基因Bcl-2表達明顯降低，即能明顯下調Bcl-2/Bax蛋白的比值，與對照組比較差異均有顯著性（P＜0.01，Fig 4，Fig 5，Tab 3）。

Tab 3　Effect of plumbagin on expression of Bax、Bcl-2 protein in HepG2 cells（±s，n=5）

Tab 3　Effect of plumbagin on expression of Bax、Bcl-2 protein in HepG2 cells（±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group　Bax protein expression rate/% Bcl-2 protein expression rate/% Control　35.800±1.311　49.733±2.120 Plumbagin 1 μmol·L-1　44.400±1.442　37.133±1.514*Plumbagin 2 μmol·L-1　54.067±1.747*　30.800±1.200*Plumbagin 4 μmol·L-1　67.933±1.747**　21.500±1.323**Plumbagin 8 μmol·L-1　94.533±1.405**　11.867±0.808**

4　討論

肝細胞癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，腫瘤細胞的轉移和侵襲是惡性腫瘤的基本特征，尤其在腫瘤發展的最后階段，控制轉移是決定患者預后的關鍵因素。腫瘤細胞的運動性在侵襲轉移中的作用已被眾多實驗所證實，遷移運動能力與侵襲之間的關系呈正相關。如何阻斷腫瘤細胞的侵襲和轉移是目前腫瘤治療研究的熱點之一。已有研究表明，某些中草藥具有抑制腫瘤侵襲和遷移的作用。白花丹醌是白花丹的主要活性成分，是從植物白花丹中提取的一種小分子萘醌化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗菌消炎、抗生殖、抗凝、抗動脈粥樣硬化、強心、抗肝纖維化、抗癌等作用［7-8］，其抗癌活性引起了廣泛的關注，研究顯示，白花丹醌對白血病、骨肉瘤、乳腺癌等有明顯的殺傷和抑制作用［9-11］。本研究以MTT法檢測白花丹醌對HepG2細胞增殖的影響，發現隨著藥物濃度的增加，其抑制作用增強，并呈劑量-效應關系。Matrigel包被的小室實驗是模擬人體內基質環境來研究腫瘤細胞的侵襲能力的實驗，本實驗觀察到，與對照組相比，白花丹醌4、8 μmol· L-1干預組可以明顯降低HepG2細胞穿透人工基底膜的細胞數量，說明白花丹醌具有明顯抑制HepG2細胞侵襲能力。

Fig 2　The microscopic images of invasion amount of HepG2 cells at different concentrations of plumbagin（×200）A：Control group；B：Plumbagin 1 μmol·L-1group；C：Plumbagin 2 μmol·L-1group；D：Plumbagin 4 μmol·L-1group；E：Plumbagin 8 μmol· L-1group

Fig 3　Annexin V-FITC show HepG2 apoptosis case at different concentrations of plumbagin

Fig 4　Effect of plumbagin on expression of Bax protein in HepG2 cells（×200）

Fig 5　Effect of plumbagin on expression of Bcl-2 protein in HepG2 cells（×200）

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制細胞自主有序的死亡，這一過程受多種促凋亡和抗凋亡的蛋白調節，其中Bcl-2家族蛋白擔任著重要的角色，Bcl-2家族成員主要定位在核膜、細胞器膜上，與膜結合是其發揮生物功效的保障［12］。Bax和Bcl-2通過形成同源二聚體或異源二聚體，來改變線粒體外膜各種通道的開放程度，從而調節細胞凋亡。當Bax形成同源二聚體是誘導細胞凋亡，特別是大于80%時，且在適當信號誘導下，細胞凋亡作用增大；Bax和Bcl-2形成異源二聚體時則抑制細胞凋亡，因而認為Bcl-2/Bax比率是啟動細胞凋亡的“分子開關”，其數值越低說明凋亡趨勢越明顯［13］。本實驗研究發現，白花丹醌能誘導HepG2細胞發生凋亡，白花丹醌作用HepG2細胞48 h，4、8 μmol·L-1組細胞凋亡率均明顯高于對照組。并且使HepG2細胞Bax蛋白水平上調，下調Bcl-2蛋白水平，即Bcl-2/Bax比值下降，并存在劑量依賴性，這可能是白花丹醌誘導肝癌細胞凋亡的分子機制之一。

綜上所述，白花丹醌能夠抑制HepG2細胞增殖，促進HepG2細胞凋亡，抑制HepG2細胞的侵襲，說明白花丹醌具有抗肝癌的作用。白花丹醌調控肝癌細胞的侵襲及凋亡的具體分子機制，有待進一步研究，為白花丹醌臨床治療肝癌提供實驗依據。

（致謝：本文全部實驗均在廣西中醫藥大學科學實驗中心完成，特此致謝！）

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Effect of plumbagin on invasion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2

XIE Jin-ling，ZHAO Chuan，LI Jun-xuan，WEI Yan-fei
（Dept of Phsiology，Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning，Guangxi530001，China）

AimTo investigate the effect of plumbagin on invasion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma（HepG2）.MethodsHepG2 cells were cultured in vitro with different concentrations of plumbagin，then cell proliferation was observed by MTT assay；cell invasion was observed by transwell invasion assay；cell apoptosis was detected by flow cytometry，and the protein expression of Bax，Bcl-2 was detected byimmunocytochemistry.ResultsMTTresults showed that plumbagin could significantly inhibit cell proliferation compared with the control group，and in a dose-dependent manner（P＜0.05）.Transwell invasion assay showed that cell invasion was significantly decreased with increasing concentrations of plumbagin（P＜0.01）.Flow cytometry showed that apoptosis rate was significantly higher in 4，8 μmol·L-1group of plumbagin compared with that of the control group （P＜0.01）.Immunocytochemistry showed that，with the increasing concentration of plumbagin，Bax protein expression increased，Bcl-2 protein expression was decreased，both in a dose-dependent manner（P＜0.01）.ConclusionPlumbagin can inhibit HepG2 cell proliferation and accelerate apoptosis of HepG2 cells，but also has the ability to inhibit HepG2 cell invasion.

plumbagin；human hepatocellular carcinoma cells HepG2；cell proliferation；invasion；cell apoptosis；Bax；Bcl-2

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.018

A

1001-1978（2016）05-0687-05

R284.1；R329.24；R329.25；R735.702.2；R977.6

2016-02-17，

2016-03-21

國家自然科學基金地區項目（No 81260675）；廣西自然科學基金面上項目（No 2013GXNSFAA019154）；廣西高等學校優秀中青年骨干教師培養工程資助項目

謝金玲（1990-），女，碩士生，研究方向：生化藥理學，E-mail：13257716536@163.com；韋燕飛（1976-），女，博士，教授，研究方向：中醫藥防治肝臟疾病基礎，通訊作者，E-mail：weiyanfei@gxtcmu. edu.cn胞增殖，促進HepG2細胞凋亡，同時具有抑制HepG2細胞侵襲的能力。