不同核酸提取方法檢測H IV病毒載量和耐藥基因的研究

劉　敏　陳秀英　梅少林　陳沙彬　雷永良浙江省麗水市疾病預(yù)防控制中心，浙江麗水　323000

不同核酸提取方法檢測H IV病毒載量和耐藥基因的研究

劉敏陳秀英梅少林陳沙彬雷永良▲
浙江省麗水市疾病預(yù)防控制中心，浙江麗水323000

目的比較5種核酸提取法提取HIV RNA的效率。方法收集2015年HIV病毒感染者血樣，使用不同核酸提取方法平行檢測Ct值及載量值，分析檢測的檢出率、敏感性、變異系數(shù)、穩(wěn)定性，并進(jìn)行耐藥擴(kuò)增。結(jié)果5種提核酸方法檢出率國產(chǎn)磁珠法最高，5種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.98，P=0.09）；Ct值從小到大順序?yàn)椋簢a(chǎn)磁珠法≥離心柱法＞大批量法≥進(jìn)口磁珠法＞試劑盒自帶法；重復(fù)性比較表明國產(chǎn)磁珠法檢測結(jié)果較穩(wěn)定；核酸膠顯示國產(chǎn)磁珠法提取RNA濃度最高；提取方法不影響耐藥關(guān)鍵位點(diǎn)檢測。 結(jié)論5種核酸提取方法均能檢測HIV信息，國產(chǎn)磁珠法提取病毒核酸進(jìn)行檢測，敏感性和穩(wěn)定性均較高。

核酸提取；熒光定量PCR；HIV載量；耐藥基因；磁珠；HIV RNA

［Abstract］Objective To compare the efficiency of HIV RNA extracted by five kinds of nucleic acid extraction methods.M ethods Blood sampleswere collected from HIV infected persons in 2015.Used differentmethods of nucleic acid extraction to detect the Ct value and the load value.The detection rate，the sensitivity，the coefficient of variation，the stability，and the drug resistancewere detected.Results Domesticmagnetic bead method had the highest detection rate in five kinds of nucleic acid method，there was no statistically significant difference of 5 kinds ofmethod（χ2=7.98，P= 0.09）.Ct values from small to large order:domestic magnetic beads≥centrifugal column method＞large quantities of extraction method≥imported magnetic beads＞phenol/chloroform cracking.Repeatability tests showed that domestic magnetic beads was stable；Nucleic acid gel showed domestic magnetic beads to extract RNA concentration was highest；Extraction method did not affect the detection of drug resistance.Conclusion Five kinds of nucleic acid extraction methods are able to detect HIV information.The viral nucleic acid extraction usingmagnetic beadsmethod，sensitivity and stability are higher.

［Key words］Nucleic acid extraction；Quantitative PCR；HIV load；Resistance gene；Magnetic beads；HIV RNA

人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）已在全球肆虐40余年。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，至2015年底預(yù)計(jì)有1500萬感染者接受抗病毒治療［1］。根據(jù)《艾滋病治療手冊》，規(guī)定接受治療的艾滋病患者必須定期檢測病毒載量，用于反映藥物療效以及預(yù)防耐藥的發(fā)生。抗病毒治療可以降低艾滋病患者血液中的病毒載量，恢復(fù)部分免疫功能。但是長期接受抗病毒治療、患者依從性差等均易導(dǎo)致對治療藥物產(chǎn)生耐藥性，繼而加劇耐藥株的傳播。非洲某些地區(qū)新發(fā)病者耐藥性高達(dá)15.2%，諸多一線治療藥物失效［2，3］。

目前HIV病毒載量檢測一般為RNA，克隆病毒基因片段關(guān)鍵在于高效提取RNA核酸。此外，對基因分型溯源分析、CD4+T細(xì)胞受體CCR5Δ32/Δ32、腫瘤循環(huán)DNA等研究也要求完整的序列片段［4-6］。核酸RNA模板提取的過程是影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵，尤其是對病毒水平較低的樣本影響會更明顯。基層疾控系統(tǒng)常用的病毒核酸提取方法主要有磁珠法和離心柱法［7，8］，多為進(jìn)口試劑，進(jìn)口試劑價格昂貴，近年來，國內(nèi)基于實(shí)時熒光定量技術(shù)與不同的核酸提取方法進(jìn)行研制，凱杰、達(dá)安基因、珠海麗珠與萬泰生物等率先研發(fā)了國內(nèi)病毒載量檢測試劑，自帶核酸提取試劑盒。本文選擇了市售常見的5種RNA核酸提取方法，對HIV感染者血樣進(jìn)行HIV病毒載量和耐藥基因檢測比較，旨在評估國產(chǎn)試劑和進(jìn)口試劑的靈敏性、重復(fù)性、核酸回收率，為基層疾病預(yù)防控制中心選擇適宜的HIV病毒RNA核酸提取方法提供參考數(shù)據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

本次納入檢測為本地區(qū)共80例HIV感染者，其中男59例，女21例，平均年齡37.08歲，經(jīng)酶聯(lián)免疫、膠體硒法和蛋白免疫印跡確證。其中58例為2015年7月1日～12月31日新發(fā)現(xiàn)的病例，男45例，女13例，未經(jīng)過治療；22例為2015年之前發(fā)現(xiàn)的病例，經(jīng)過治療；全部患者均知情同意。

1.2試劑與儀器

國產(chǎn)磁珠試劑（NP968，西安天隆科技）；promage公司進(jìn)口磁珠試劑（Maxwell 16）；離心柱法試劑（廣州達(dá)安基因）；德國QIAGEN熒光定量載量檢測試劑盒自帶核酸提取法 （careHIV-1 RT-PCR Kit），thermo scientific大批量提取儀器及試劑（96份磁珠處理儀）；德國QIAGEN熒光定量載量檢測試劑盒（careHIV-1 RT-PCR Kit，Qiagen）。7500熒光定量檢測儀為ABI公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 使用EDTA抗凝離心管采血約3mL，顛倒混勻取全血約500μL保存?zhèn)溆茫?500 rpm，4℃，離心5min，取上層血漿、中間富含PBMC層約400μL、余血清約500μL分別保存于凍存管備用。非抗凝管采血800μL，37℃水浴約30min，取上層血清保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鰳颖救坑?80℃保存。

1.3.2核酸提取按試劑盒說明書進(jìn)行，國產(chǎn)/進(jìn)口磁珠法、大批量法提取原理為磁珠吸附核酸；離心柱法原理為煮沸裂解；試劑盒自帶法原理為苯酚氯仿抽提。

1.3.3不同核酸提取方法檢測HIV病毒載量的方法將80份血樣分別采用5種核酸提取方法進(jìn)行RNA提取后，于-40℃保存?zhèn)溆谩⑸鲜鰳悠钒丛噭┖姓f明書進(jìn)行HIV病毒載量檢測，其中，反應(yīng)液34.1μL，酶0.5μL，Enhancer 0.4μL，提取RNA核酸模板15μL，混勻后上機(jī)。感染者載量計(jì)算采用機(jī)讀結(jié)果乘以提取后的核酸溶液體積和初始加的血樣體積的比值。

1.3.45種核酸提取方法的穩(wěn)定性檢測方法取上述陽性標(biāo)本中的40份血樣，梯度濃度為＜103IU/mL、103IU/mL、104IU/mL、105IU/mL，每種梯度各10份樣本。隔天重復(fù)3次分別采用5種核酸提取方法進(jìn)行RNA提取后進(jìn)行HIV病毒載量檢測，計(jì)算10份樣本Ct平均值，變異系數(shù)（CV）值。考察因素為5種方法組間比較，以及不同載量濃度樣本間比較。

1.3.5不同核酸提取方法對HIV病毒耐藥基因檢測結(jié)果的影響 在上述5種提核酸方法提取的RNA核酸中選取3份樣本，梯度為102IU/mL、103IU/mL、105IU/mL，且相互之間載量相差1 log，進(jìn)行兩輪巢氏PCR擴(kuò)增pol基因區(qū)［6］，上下游擴(kuò)增引物見董永慧等［9］報道；同時選取2個耐藥血樣，用5種方法提取RNA核酸。對所擴(kuò)增的10份樣本委托杭州擎科生物公司進(jìn)行測序，產(chǎn)物長1316 bp。序列比較分析使用contig、BioEdit軟件拼接并比對，序列拼接后將文本文檔導(dǎo)入比較不同位點(diǎn)和提交斯坦福大學(xué)in-house網(wǎng)站，分析耐藥突變［10，11］。將本實(shí)驗(yàn)室測得的12份耐藥樣本，耐受藥物與某省疾控中心權(quán)威機(jī)構(gòu)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。測序引物序列見表1。

表1　測序引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件16.0版本，檢測陽性率使用行×列χ2檢驗(yàn)，樣本Ct平均值用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.15種核酸提取方法的HIV病毒載量檢測結(jié)果

對80份樣品用不同核酸提取方法提取的RNA核酸，檢測陽性率國產(chǎn)磁珠法最高。5種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.09）；國產(chǎn)磁珠法和離心柱法與試劑盒自帶法檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.10，P=0.02；χ2=4.10，P=0.04）。見表2。

5種核酸提取方法均檢測為陽性的60份標(biāo)本中，國產(chǎn)磁珠法和離心柱法平均Ct值最小，其次為大批量法和進(jìn)口磁珠法，試劑盒自帶提取方法平均Ct值最大。表3中5種方法組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 2.026，P=0.167），兩兩比較顯示國產(chǎn)磁珠法和離心柱法與試劑盒自帶法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041、P=0.043）。

2.25種核酸提取方法的穩(wěn)定性檢測結(jié)果

所有提取方法的檢測結(jié)果均較穩(wěn)定，CV值均＜5%，但其中國產(chǎn)磁珠法在5種提核酸方法中CV值最小，在0.77%～2.42%之間（表4）；103IU/mL樣本CV值＞104IU/mL和105IU/mL。同一樣本3次檢測變化范圍在0.08 log以內(nèi)。

2.35種核酸提取方法對HIV病毒耐藥基因檢測結(jié)果

分別對5種方法提取的3個梯度的核酸樣品，進(jìn)行HIV病毒耐藥基因檢測結(jié)果，低載量樣本僅使用國產(chǎn)磁珠法及離心柱法處理可擴(kuò)增成功，但國產(chǎn)磁珠法擴(kuò)增條帶更明顯。另外3種方法無擴(kuò)增條帶。高載量樣本5種提取方法均能高效穩(wěn)定擴(kuò)增，測序結(jié)果5種提核酸方法所得序列片段略有不同，但不影響耐藥關(guān)鍵位點(diǎn)檢測（圖1）。

表2　5種提核酸方法檢出率比較

3　討論

HIV核酸提取是載量和耐藥基因檢測的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。目前病毒載量檢測試劑主要有進(jìn)口試劑和國產(chǎn)試劑。進(jìn)口試劑提取核酸已經(jīng)在疾病預(yù)防控制中心使用多年，該方法需要多步驟離心提取高質(zhì)量、高純度的核酸，依賴羅氏、梅里埃等檢測儀［12］，設(shè)備試劑昂貴，操作技術(shù)專業(yè)要求高。而國產(chǎn)試劑主要采用磁珠法，利用變性劑破碎細(xì)胞，將游離出的核酸吸附在離心柱的硅膠模或者磁珠中的表面硅基結(jié)合，操作簡單，且是全自動化平臺，在成本方面也占有優(yōu)勢，易于推廣。

從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，國產(chǎn)磁珠法值與離心柱法相近，檢出率最高［13］。國產(chǎn)磁珠法提取時間及人力投入優(yōu)于離心柱法，但需要購置專用儀器。磁珠法水相洗滌，對病毒特異性核糖體RNA進(jìn)行捕獲擴(kuò)增檢測，有效排除雜質(zhì)干擾，提高效率和純度。試劑盒自帶法得率不高或與病毒溶解度相關(guān)，提取物純度和濃度對PCR反應(yīng)體系產(chǎn)生影響［14］。在其他疾病包括病毒病、腫瘤等研究中與本研究核酸提取結(jié)果相似［15，16］，磁珠法在核酸提取中具優(yōu)勢，尤其是在痕量樣品的提取中效果更為顯著。

通過穩(wěn)定性比較可知檢測敏感性高的方法穩(wěn)定［17，18］，從載量濃度上看，RNA濃度為104IU/mL樣本檢測重復(fù)性最好。載量低的樣本重復(fù)性最差，即載量低降解快。≥105IU/mL樣本對檢測重復(fù)性有一定影響。相同樣本，即使使用同種方法相近時間內(nèi)檢測，結(jié)果仍有0.08 log值的差異，所以建議觀察載量控制效果應(yīng)采用同一儀器同一方法比較。

圖1　5種提核酸方法處理標(biāo)本擴(kuò)增結(jié)果

表3　5種提核酸方法Ct平均值比較（±s）

表3　5種提核酸方法Ct平均值比較（±s）

注：表中數(shù)字為20份樣本平均Ct值（±s）

樣本5種提核酸方法國產(chǎn)磁珠法　進(jìn)口磁珠法　離心柱法　試劑盒自帶法　大批量法低載量的20份標(biāo)本載量居中的20份標(biāo)本高載量的20份標(biāo)本28.01±2.41 26.09±2.38 24.22±2.37 30.21±3.06 28.67±2.96 26.77±3.49 28.06±2.52 26.12±2.64 24.30±2.07 32.95±1.18 29.96±3.26 27.30±4.76 30.05±3.03 28.55±2.59 26.43±2.36

表4　5種提核酸方法的穩(wěn)定性比較結(jié)果（Ct平均值）

核酸膠結(jié)果顯示國產(chǎn)磁珠法提取RNA濃度高，提取的核酸能滿足耐藥基因測序要求，且不影響耐藥關(guān)鍵位點(diǎn)檢測，一般認(rèn)為磁珠提取能降低抑制劑濃度、減少降解短核酸片段［19］。載量低的樣本和進(jìn)口磁珠法更易擴(kuò)增出非目的片段。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有高載量卻擴(kuò)增失敗的樣本，預(yù)計(jì)與其亞型有關(guān)［20］；本實(shí)驗(yàn)有載量檢測不到卻擴(kuò)增成功的樣本，原因?yàn)閮奢哖CR大大提高檢測靈敏性。

綜上所述，國產(chǎn)磁珠法與離心柱法的靈敏度、重復(fù)性、核酸回收率都較高，對于基層疾控中心及時檢測病毒載量可代替進(jìn)口試劑盒，用于HIV病毒載量及耐藥基因檢測。

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Study of different nucleic acid extraction methods for detection of HIV load and drug resistance gene

LIU MinCHEN XiuyingMEIShaolinCHEN ShabinLEIYongliang
LishuiCenter for Disease Control and Prevention in Zhejiang Province，Lishui323000，China

R512.91

B

1673-9701（2016）20-0111-04

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014KYB318）；浙江省麗水市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014RC19）

2016-05-13）