Survivin基因多態性與結直腸癌發病風險的相關性分析*

王健

Survivin基因多態性與結直腸癌發病風險的相關性分析*

王健①

目的：探討Survivin基因多態性與結直腸癌發病風險的關聯。方法：選取2013年1月-2015年5月本院收治的直腸癌患者186例作為研究組，同時選取健康者194例作為對照組。抽取兩組患者外周血并使用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取DNA，采用聚合酶鏈式反應（PCR）和連接酶檢測反應（LDR）對rs9904341C/G多態位點進行基因分型，比較兩組的基因分型結果。結果：研究組C/C基因頻率為44.62%，高于對照組的28.35%，C/G基因頻率為39.78%，低于對照組的49.48%，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；G/G基因頻率為15.59%，低于對照組的22.16%，比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，研究組Survivin C/G基因型的OR值為0.764（0.54～1.04）（P=0.020），C/C基因型的OR值為1.376（0.91～2.07）（P=0.031），G/G基因型的OR值為1.004（0.84～1.13）（P=0.121），攜帶C/G基因會降低患者的發病風險，而攜帶C/C基因則會升高發病危險。結論：Survivin基因多態性與結直腸癌發病風險有較高的關聯性，為結直腸癌的診斷及探討靶標相關miRNA多態作為結直腸癌風險個體識別的標志及其機制提供理論依據和實驗基礎，也意味著尋找和篩選與腫瘤發病風險密切相關的miRNA多態有望成為系統研究腫瘤早期診斷及發病機制的有效途徑，因此具有廣闊的實用價值和應用前景。

Survivin基因多態性； 結直腸癌； 發病風險

First-author's address：The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China

結直腸癌（colorectal cancer，CRC），又稱結腸直腸癌、大腸癌，包括腫瘤在大腸、直腸及闌尾的增生。一般認為，癌癥起源于大腸中的腺瘤性瘜肉（Polyp）。作為消化道常見惡性腫瘤，結直腸癌發病率占胃腸道腫瘤的第2位。在世界范圍內，結直腸癌是癌癥死亡的第3大病因，其發病率在世界不同地區差異很大，以北美、大洋洲最高，歐洲居中，亞非地區較低。中國南方，特別是東南沿海地區高于北方。事實上，據估計2013年，僅美國地區就有50 000人因結腸癌死亡，而全球因結直腸癌死亡的病例可高達500 000人之多［1］。近年來，隨著我國人民生活方式、飲食結構的改變及人口老齡化，我國結直腸癌的發病率和死亡率呈現逐年上升的趨勢，腫瘤的檢出時間直接決定了結直腸癌患者的生存和預后。然而，由于結直腸癌在早期常常無明顯癥狀，因此大部分患者確診時均已屬于晚期。手術仍然被公認是最有效的治療結直腸癌的手段，然而統計結果顯示局部淋巴結轉移者的術后復發率仍高達50%。即使是不存在局部淋巴結轉移的pN0結直腸癌患者，其復發率仍也高達25%。由于早期結直腸癌患者治療后5年生存率約為90%，但晚期和轉移性患者的總生存率僅為15%。因此，提高早期診斷率和進行風險預測對結直腸癌患者提高生存率和預后至關重要。結直腸癌也因其較高的發病率和死亡率而備受關注［2-6］。本研究旨在探討Survivin基因多態性與結直腸癌發病風險之間的關聯，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月-2015年5月本院收治的直腸癌患者186例作為研究組，其中男103例，女83例；年齡35～76歲，平均（47.8±5.7）歲。選取同期健康者194例作為對照組，其中男106例，女88例；年齡32～79歲，平均（48.1±6.1）歲。兩組患者在性別、年齡等方面比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2納入及排除標準 納入標準：（1）經臨床確診并通過病理學驗證證實為直腸癌者；（2）各項功能性指標符合研究標準，即功能狀態評分≥60者；（3）具有明確的可測量病灶者；（4）患者或其家屬同意并簽署知情同意書。排除標準：（1）對化療藥物不耐受者；（2）肝、腎功能存在異常者；（3）病情嚴重，預計生存期＜5個月者。

1.3儀器與試劑

1.3.1儀器 離心機（LXJ-64-01，北京醫療儀器修理廠）、電子天平（PB3002-S，瑞士Mettler公司）、恒溫磁力攪拌器（HJ-3，江蘇金壇醫療儀器廠）、PCR擴增儀Mastercycler5333（Eppendorf company，Germany）、Eppendorf Research移 液 器（Eppendorf company，Germany）、ABI3730XL測序儀（上海生物工程有限公司）。

1.3.2試劑 氯化鎂（上海易佰聚生物公司）、dNTPs（Obiogene，Germany）、Taq-DNA聚合酶（上海生物工程有限公司）、100 bp DNA ladder（華美生物工程公司）、EDTA（美國Sigma）、引物合成（上海生物工程有限公司）、SDS（美國Sigma）、蛋白酶K（德國Merck公司）、其他試劑均為分析純

1.4方法

1.4.1外周血DNA提取 兩組患者均采取側臥位，取外周靜脈血5 mL，加入抗凝劑搖勻后于4 ℃保存備用，于1周內提取DNA，具體過程如下：將與抗凝劑混合的血液樣本加蒸餾水至50 mL，于2500 rpm離心10 min，去上層清夜，重復此操作3次。向沉淀物中加入0.1% Triton-X100同上離心，去上清后用蒸餾水洗滌1～2次。向沉淀物加3 mL DNA提取液，充分混合后加入10% SDS 150 μL，震蕩至無凝塊。加入蛋白酶K混合均勻，于37 ℃水浴中過夜。加入NaCl混合均勻后于2500 rpm離心15 min，取上層清液，使用乙醇洗滌1～2次，待乙醇揮發后用200 μL TE溶解，4 ℃下放置儲存。

1.4.2PCR反應 以DNA為模板使用聚合酶鏈反應擴增rs9904341基因序列。

1.4.3引 物 設 計 及 合 成 使 用Genetool軟件設計Survivin基因上的多態性位點特異性核苷酸序列引物，rs9904341C/G 上游引物：5，-CGCCTCTACTCCCAGAAGGC-3，，下游引物：5，-ACAGGAGAGCTTTACAGGGTG-3，。

1.4.4LDR反應 95℃變性3 min，30個循環，每個循環2個溫度，94 ℃ 30 s，56℃ 3 min。LDR序列包括：（1）S1-TC：CATTAACCGCCAGATTTGAATCGCC；（2）S1-TG：TTTCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCG；（3）S1-TR：-P-GGACCCGTTGGCAGAGGTGGCGGCG-FAM-。LDR反應體系包括：PCR產物2 μL，10*Taq DNA ligase buffer 1μL；Taq DNA ligase（40 U/μL）0.125 μL，探針（10p） 0.01 μL/條，蒸餾水補至10 μL。

1.4.5序列檢測 使用ABI3730XL測序儀進行檢測，取鏈接產物1 μL，加10 μL上樣，95 ℃變性3 min，立即冰水浴。使用Genemapper進行數據分析。1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x-±s）表示，多組均數間的比較采用單因素方差分析，再用Dunnett檢驗進行post-hoc分析，同時計算各位點OR值，衡量患病風險（OR值＞1提示患病風險增加），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組Survivin基因rs9904341C/G多態性與結直腸癌發病風險比較 研究組C/C基因頻率為44.62%，高于對照組的28.35%，C/G基因頻率為39.78%，低于對照組的49.48%，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；G/G基因頻率為15.59%，低于對照組的22.16%，比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　兩組Survivin基因rs9904341C/G多態性與結直腸癌發病風險比較 例（%）

2.2兩組Survivin基因rs9904341C/G多態性與結直腸癌發病風險相關性分析 攜帶C/G基因人群患結直腸癌的風險較低，其OR值為0.764（0.54～1.04）；攜帶C/C基因較C/G基因型人群患結直腸癌的風險較高，其OR值為1.376（0.91～2.07），見表2。

表2　兩組Survivin基因rs9904341C/G多態性與結直腸癌發病風險相關性分析

3　討論

近年來，在結直腸癌診斷方面，各國科研人員都做了多方嘗試，試圖對結直腸癌的早期診斷、定位和分期進行更準確的詮釋。目前，主要集中在腸道排泄物診斷法、結腸鏡診斷法和影像學診斷法等，盡管如此，各國科學家一直以來從未停止尋找早期診斷和風險預測結直腸癌有效途徑的腳步。單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在人群中出現頻率≥1%的先天突變，存在于整個基因組，是最常見的遺傳變異［7］。作為第3代遺傳標志，是miRNA參與腫瘤細胞生物學作用的調控機制之一。近年來，miRNA多態與腫瘤發病風險關系的報道日漸增多。研究認為，出現在pri-，pre-和成熟miRNA的多態均能夠影響miRNA的功能，進而影響上百種基因及其通路蛋白的表達。與此同時，pri-miR-15a/miR-16 C/T多態被發現與家族性慢性淋巴細胞白血病的發病風險相關；Calin GA pre-mir-146a rs2910164 （G/C） SNP被認為與日本人群及中國人群的胃癌發病風險有關，且影響了成熟miR-146a的表達。這些越來越多的證據在提示SNP與腫瘤密切關系的同時，也意味著尋找和篩選與腫瘤發病風險密切相關的miRNA多態，將有望成為系統研究腫瘤早期診斷及發病機制的有效途徑［8-12］。

微小核苷酸（microRNA，miRNA）做為非編碼RNA中的一種，是真核生物中參與基因轉錄調控的18～23個核酸（nt）的單鏈RNA分子，通過堿基的完全或不完全互補，可與靶標基因的mRNA序列3，非編碼區結合，從而使靶標的mRNA轉錄“沉默”或抑制（下調）［13-16］。正常生理狀態下，miRNA具有調控細胞增殖、凋亡、分化與發育的重要作用。異常表達的miRNAs密切參與結直腸癌的增殖、分化、凋亡、轉移、浸潤及血管生成等發展過程。目前，血液抽提miRNA進行腫瘤早期預測在逐步開展，并展現了良好的應用前景［17］。

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在人群中出現頻率≥1%的先天突變，存在于整個基因組，是最常見的遺傳變異。作為第3代遺傳標志，是miRNA參與腫瘤細胞生物學作用的調控機制之一［18］。近年來，miRNA多態與腫瘤發病風險關系的報道日漸增多。研究認為，出現在pri-，pre-和成熟miRNA的多態均能夠影響miRNA的功能，進而影響上百種基因及其通路蛋白的表達［19］。與此同時，pri-miR-15a/miR-16 C/T多態被發現與家族性慢性淋巴細胞白血病的發病風險相關；Calin GA pre-mir-146a rs2910164 （G/C） SNP被認為與日本人群及中國人群的胃癌發病風險有關，且影響了成熟miR-146a的表達。這些越來越多的證據提示SNP與腫瘤關系密切的同時，也意味著尋找和篩選與腫瘤發病風險密切相關的miRNA多態將有望成為系統研究腫瘤早期診斷及發病機制的有效途徑［20］。

本文采用對比分析的方法，探討rs9904341C/G多態位點與結直腸癌發病風險的關聯。結果表明研究組C/C基因頻率為44.62%，高于對照組的28.35%，C/G基因頻率為39.78%，低于對照組的49.48%，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；G/G基因頻率為15.59%，低于對照組的22.16%，比較差異無統計學意義（P＞0.05）。OR值的分析發現，與對照組比較，研究組C/C基因為1.376 （0.91～2.07），C/G基因為0.764（0.54～1.04），比較差異均有統計學意義（P＜0.05），而G/G基因為1.004（0.84～1.13），比較差異無統計學意義（P＞0.05）。由此可見，攜帶C/G基因會降低患者的發病風險，而攜帶C/C基因則會升高發病危險。本文的研究結果表明Survivin基因多態性與結直腸癌發病風險有較高的關聯性，為結直腸癌的診斷及探討靶標相關miRNA多態作為結直腸癌風險個體識別的標志及其機制提供理論依據和實驗基礎，也意味著尋找和篩選與腫瘤發病風險密切相關的miRNA多態有望成為系統研究腫瘤早期診斷及發病機制的有效途徑，因此具有廣闊的實用價值和應用前景。

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Analysis on Association of Survivin Gene Polymorphisms with the Risk of Colorectal Cancer

WANGJian.//Medical Innovation of China，2016，13（14）：007-010

Objective：To investigate the association of Survivin gene polymorphisms with the risk of colorectal cancer.Method：From January 2013 to May 2015，186 cases of rectal cancer in our hospital were selected as the research group and 194 cases of healthy persons were selected as control group at the same time. They were collected peripheral blood and extract DNA by using proteinase K digestion and saturated sodium chloride salting out method，and polymerase chain reaction （PCR），ligase detection reaction （LDR） were used for rs9904341C/G polymorphism genotyping，the genotyping results in two groups were compared.Result：The C/C gene frequency was 44.62% in the research group，higher than 28.35% of the control group，C/G gene frequency was 39.78%，lower than 49.48% of the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）. The G/G gene frequency was 15.59%，lower than 22.16% of the control group，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Compared with the control group，in the research group，the OR value of Survivin C/G gene was 0.764（0.54-1.04）（P=0.020），the OR value of Survivin C/C gene was 1.376（0.91-2.07）（P=0.031），the OR value of Survivin G/G gene was 1.004（0.84-1.13）（P=0.121）.The risk of colorectal cancer was reduced in the group with C/G gene，while was elevated in the group with C/C gene.Conclusion：Survivin gene polymorphism and risk of colorectal cancer have a higher relevance，for the diagnosis of colorectal cancer and explore the target miRNA polymorphism as a symbol of individual identification of colorectal cancer risk and its mechanism to provide theoretical and experimental basis，also means that finding and screening miRNA polymorphism closely related to the risk of cancer is expected to become the effective way of system for the study of tumor early diagnosis and pathogenic mechanism，so it has great practical value and broad application prospect.

Survivin gene polymorphism； Colorectal cancer； Risk of disease

江西省衛生計生委科技計劃項目（20155650）

①江西中醫藥大學附屬醫院 江西 南昌 330006

王健

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.002

2016-01-11） （本文編輯：李穎）