內蒙古漢族尋常型銀屑病REL基因多態位點檢測

王　勇　韓建文　白云花　孫志強　阿拉騰楚魯　劉　佳　李東霞　呂新翔　烏日娜

·短篇論著·

內蒙古漢族尋常型銀屑病REL基因多態位點檢測

王勇1韓建文2白云花3孫志強2阿拉騰楚魯2劉佳2李東霞2呂新翔2烏日娜2

目的： 檢測內蒙古漢族人尋常型銀屑病（PsV）患者禽網狀內皮組織增殖病毒癌基因V-Rel同源基因（REL）的多態性。方法： 提取301例PsV患者及292名正常對照外周血DNA，利用連接酶檢測反應檢測REL基因區域的4個單核苷酸多態性（SNP）（rs702873、rs 842636、rs13031237和rs13017599）。結果： PsV患者rs702873和rs842636的等位基因頻率分別為0.126和0.128，對照組中分別為0.182和0.181，差異有統計學意義（P<0.05）且rs702873和rs 842636間存在強連鎖不平衡（D'= 0.993，r2=0.980）。rs13031237和rs13017599等位基因頻率在PsV患者和對照組中差異無統計學意義（P>0.05）。結論： REL基因位點（rs702873和rs 842636）多態性可能與內蒙古漢族人PsV的易感性相關。

尋常型銀屑病? 單核苷酸多態性

銀屑病是常見的紅斑鱗屑性皮膚病。遺傳、免疫在銀屑病的發病機制中有著重要的作用。近年來的遺傳學研究發現了一批銀屑病易感基因，特別是核因子κB（NF-κB）病理通路中的禽網狀內皮組織增殖病毒癌基因V-Rel同源基因（REL）與尋常型銀屑病（PsV）、銀屑病性關節炎的相關性在歐洲人群中已有報道［1-3］。并且REL基因與類風濕性關節炎也有相關性［3］。但目前尚無漢族人銀屑病與REL基因多態性的相關研究。本研究選擇則位于REL基因區域的4個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP），利用連接酶檢測反應（ligase detection reaction，LDR）對其進行基因分型，探討其與漢族人PsV的相關性。

1　資料和方法

1.1資料

1.1.1研究對象 從內蒙古醫科大學附屬醫院收集漢族PsV患者301例，平均年齡（47.00±16.77）歲，平均發病年齡（33.48±15.48）歲?男女比例：1.76∶1，正常漢族對照292名，平均年齡（35.90±14.65）歲?男女比例：1.12∶1。經知情同意并簽字后抽取外周靜脈血5mL，EDTA抗凝，置于-80度冰箱保存備用。所有患者經臨床及病理證實，符合PsV診斷標準。所有對照排除銀屑病及其他自身免疫疾病，排除銀屑病家族史。本研究經過內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會通過，并在實施過程中遵守赫爾辛基宣言。

1.1.2SNPs選擇根據既往文獻報道，在REL基因區域選擇4個在歐洲人群中報道的銀屑病相關的SNP（rs702873、rs842636、rs13031237和rs13017599）［1-3］。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 利用基因組DNA提取試劑盒（康寧生命科學有限公司，中國蘇州）提取患者及對照基因組DNA，利用分光光度儀檢測260 nm和 280 nm吸光度，計算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測DNA質量，所有DNA樣本均合格。

1.2.2引物及探針的合成利用Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件（http：//frodo.wi.mit.edu/）和Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.，USA）軟件設計特異性引物和LDR探針，針對每個SNP位點設計兩條引物，要盡量保證所有SNP位點的引物的T值相同，PCR反應引物序列見表1。根據LDR探針設計原則設計LDR的上下游探針［4］，上游探針5'端用磷酸化修，LDR反應探針序列見表2。

表1　PCR反應引物序列

表2　LDR反應探針序列

1.2.3多重PCR反應 PCR反應體系為（20μL） 1 μL模板，2μL Buffer緩沖液，0.6μL Mg2+，2μL dNTP，0.2μL TaqDNA聚合酶，2μL引物混合液，加水補足。PCR反應條件：95℃預變性2 min?94℃30 s。56℃退火1.5 min。65℃30s，35個循環。最后65℃延伸10 min。

1.2.4多重LDR反應 LDR反應體系為（10μL） 1 μL Buffer緩沖液，1μL探針混合液，0.05μL Taq DNA連接酶，4μL PCR產物，加水補足10μL。探針混合液濃度為2 pmol/μL。LDR反應條件：95℃2 min預變性，94℃15 s，50℃25 s，進行40個循環。

1.2.5測序與基因分型反應產物 經過ABI3730測序儀測序分析，最后用Genemapper軟件進行數據分析，判讀各位點上各樣本的基因分型。

1.2.6統計學方法 所有SNP分型數據質控、統計分析利用PLINK 1.07軟件完成。（http：//pngu.mgh. harvard.edu/purcell/plink/）［5］。計算4個SNP的等位基因頻率，病例組及對照中分別進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。卡方檢驗（χ2）比較病例組及對照組等位基因頻率及基因型頻率，并計算等位基因的相對危險度估計值比值比OR及其95%可信區間（95%CI）。對4個SNP間進行連鎖不平衡檢驗，計算兩兩間的r2和D'值。根據患者發病年齡（早發型：發病年齡<40歲?晚發型：發病年齡≥40歲）進行分層分析。所有統計檢驗均為雙側概率檢驗，根據Bonferroni多重檢驗校正原理，P<0.0125（0.05/4）為差異有顯著性。

2　結果

2.1樣本及SNP質控病例及對照樣本在性別及年齡無顯著性差異，具有可比性（P>0.05）。4個SNP在病例及對照中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P> 0.05）。

2.2等位基因頻率 比較2個SNP的等位基因頻率與對照組差異具有顯著性，達到Bonferroni校正水平（P<0.0125）（表3）。rs702873的等位基因A在PsV組的頻率為12.6%，對照組中頻率為18.2%（P= 0.0091，OR=0.65）。rs842636的等位基因A在PsV組的頻率為12.8%，對照組中頻率為18.1%（P= 0.0122，OR=0.66）。另外2個SNP（rs13031237和 rs13017599）的等位基因頻率在病例組和對照組中無差異（P>0.6）。rs702873和rs842636間存在強連鎖不平衡（D'=0.993，r2=0.980）。控制rs702873后，rs842636與PsV無相關性（Pconditional=0.72），同樣控制rs842636后，rs702873也沒有相關性（Pconditional=0.47）。

根據發病年齡分層分析結果顯示，僅在晚發型PsV組中，rs702873和rs842636的等位基因頻率與對照組的差異，但未能達到Bonferroni校正水平（P分別為0.0134和0.0207）。在早發型病例組無顯著性（P> 0.05）。rs13031237和rs13017599的等位基因頻率在分層分析中均無顯著性差異（P>0.55）。

表3　四個SNP與PsV相關性及根據發病年齡分層分析

2.3基因型分析及根據發病年齡分層結果 在不同遺傳模式下比較病例組和對照組間基因型頻率，發現rs702873在顯性遺傳模式下，基因型AA+AG在PsV組中頻率為0.239，對照組中頻率為0.336（P= 0.0099，OR=0.62，95%CI：0.43～0.89），隱形遺傳模式下無顯著性。在分層分析后，早發型和晚發型的基因型頻率差異無顯著性差異（P>0.0125）。在顯性模式下，PsV組和對照組間（P=0.0143）、晚發型與對照組間（P=0.0347）的差異顯著，但未能達到Bonferroni校正水平。rs842636、rs13031237和rs13017599的基因型分析及根據發病年齡分層分析中均無顯著性差異（P>0.0125）。

3　討論

REL基因位于2p16.1，編碼c-Rel蛋白是NF-κB通路中的一種泛素蛋白。參與調節多種免疫反應、自身免疫相關基因的表達［6］。

既往在歐洲人群中的多項研究報道了REL與銀屑病及銀屑病性關節炎的相關性［1-3］。本研究基于既往歐洲人群的研究對位于REL基因區域的4個SNP與PsV的相關性進行研究，證實了REL基因多態性與漢族人具有相關性。2個相關的SNP（rs702873和rs842636）間存在強連鎖不平衡，提示2個SNP可能代表同一個關聯信號。既往研究發現NF -κB病理通路中的一些相關基因均與銀屑病具有相關性，例如核因子kB抑制蛋白α亞基（NFKB1A）［7］、人腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（TNFAIP3）［8］以及TNFAIP3相互作用蛋白1（TNIP1）［8-10］。這些研究提示NF-κB病理通路在銀屑病的發病機制中具有重要的作用。

但是本研究沒有發現rs13031237和rs13017599兩個SNP與銀屑病的相關性。查詢既往研究文獻，比較這兩個SNP在歐洲人群和漢族人群的等位基因頻率，發現存在明顯差異。rs13031237的等位基因T和rs13017599的等位基因A在本研究中頻率很低（小于0.03），但是在歐洲人群中的等位基因常見變異（頻率大于0.29）［2，3］。這一發現提示可能存在遺傳異質性。可能是由于漢族人和歐洲人群中這一區域遺傳變異的連鎖不平衡關系不同導致的。rs702873在顯性模式下與PsV的相關性最為顯著，提示這一遺傳變異呈顯性遺傳模式。在根據發病年齡分層分析結果顯示rs702873和rs842636與晚發型PsV具有相關性。這一結果提示這2個SNP可能與晚發型PsV的易感性相關，但是由于樣本量不夠大，未能達到Bonferroni校正水平，還需要更大樣本量的驗證實驗來證實這一假設。

本研究通過對REL基因區域4個SNP進行分型研究（rs702873、rs842636、rs13031237和rs13017599），證實了其與漢族人PsV的相關性，REL基因可能是多個種族中銀屑病的共同易感基因，但不同種族間存在有遺傳異質性。更進一步提示REL基因在銀屑病發病機制中發揮著重要的作用。本研究仍存在一些不足之處：第一，由于樣本量有限，我們不能排除rs13031237和rs13017599與漢族人銀屑病的相關性，也不能除外rs702873和rs842636與早發型PsV的相關性?第二，本研究所分析的4個SNP均不是功能變異，仍需要進一步的精細定位研究尋找導致影響銀屑病易感性的原因變異?第三，REL基因多態性如何影響其基因功能以及如何影響免疫系統功能，仍需要進一步功能學研究。

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［2］Ellinghaus E，Stuart PE，Ellinghaus D，et al.Genome-wide meta-analysis of psoriatic arthritis identifies susceptibility locus at REL［J］.J Invest Dermatol，2012，132（4）：1133-1140.

［3］AliFR，Barton A，Smith RL，etal.An investigation of rheumatoid arthritis loci in patientswith early-onset psoriasis validates association of the REL gene［J］.Br JDermatol，2013，168（4）：864-866.

［4］Yi P，Chen Z，Yu L，et al.Development of a PCR/LDR/ capillary electrophoresis assay with potential for the detection of a beta-thalassemia fetalmutation inmaternal plasma［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2010，23（8）：920-927.

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（收稿：2015-09-14）

Detection of the polym orphism s of REL gene in the patients w ith psoriasis vulgaris in Han nationality of Inner Mongolia

WANG Yong1，HAN Jianwen2，BAIYunhua3，SUN Zhiqiang2，ALATENGChulu2，LIU Jia2，LIDongxia2，LV Xinxiang2，WU Rina2.
1.Department ofRheumatology，the Affiliated Hospital of InnerMongolia Medical University，Hohhot010050，China?2.Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China?3.Department of Dermatology，Hulunbeier People's Hospital，Hulunbeier021000，China

HAN Jianwen，E-mail：hanjianwen1981@hotmail.com

Objective：To detect the polymorphisms of REL（v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog）in Han nationality of Inner Mongolia.M ethods：DNA was extracted from the peripheral blood of 301 patients and 292 healthy controls.The polymorphisms of REL gene（rs702873，rs 842636，rs13031237 and rs13017599）were genotyped by PCR-based ligase detection reaction（PCR-LDR）.Results：The genotype frequencies of rs702873 and rs 842636 in the patientswere 0.126 and 0.128 and those in controlswere 0.182 and 0.181，with significantdifference（P<0.05）.Therewas a linkage disequilibrium of rs702873 and rs 842636.There was no significant difference in rs13031237 and rs13017599 between the patients and controls（P>0.05）.Conclusion：The polymorphisms of REL gene（rs702873 and rs842636）are associated with psoriasis vulgaris in Han nationality of Inner Mongolia.

psoriasis vulgaris?single nucleotide polymorphisms

國家自然科學基金（編號：31160192）?內蒙古醫科大學青年創新基金項目（編號：NY2011QN005）?內蒙古自治區衛生和計劃生育委員會醫療衛生科研計劃項目（編號：201303057）?

內蒙古自治區高等學校青年科技英才支持計劃（編號：NJYT -14-B17）

1內蒙古醫科大學附屬醫院風濕科，呼和浩特，010050

2內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科，呼和浩特，010050

3呼倫貝爾市人民醫院皮膚科，呼倫貝爾市，021000

韓建文，E-mail：hanjianwen1981@hotmail.com