MiR-200a對結直腸癌SW1116細胞侵襲和遷移的影響

李懿君，李　昊，尹　玉，孫晶璐，江　燕，詹鶴琴，楊　楓，詹　磊

MiR-200a對結直腸癌SW1116細胞侵襲和遷移的影響

李懿君，李昊，尹玉，孫晶璐，江燕，詹鶴琴，楊楓，詹磊

目的 探討微小RNA（miR）-200a的過表達對結直腸癌SW1116細胞遷移和侵襲能力的影響。方法 利用LipofectamineTM2000瞬時轉染含miR-200a的質粒，實驗組將載有miR-200a的質粒轉染至結直腸癌SW1116細胞中，細胞對照組結直腸癌SW1116細胞不做任何處理；應用實時定量PCR法分析miR-200a的表達變化，劃痕實驗檢測細胞遷移能力的改變、Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力的改變。結果 實時定量PCR結果表明，與細胞對照組比較，實驗組經瞬時轉染后miR-200a的表達水平顯著升高（P＜0. 01）；劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗表明外源性過表達miR-200a可促進結直腸癌SW1116細胞的遷移和侵襲能力，與細胞對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。結論miR-200a能明顯促進結直腸癌SW1116細胞的侵襲和遷移。

結直腸癌；miR-200a；侵襲；遷移

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.014.html

結直腸癌是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤，常發生侵襲、轉移［1］。結直腸癌的早期癥狀通常很難被發現，患者確診時往往已是晚期，已經發生了遠處轉移，甚至轉移到了肝臟。發生了轉移的結直腸癌患者的平均生存時間不到2年［2］，因此，探討結直腸癌的發生發展的原因以及侵襲轉移的分子機制，對結直腸癌的發病以及轉移進行預測、診斷和預后判斷等是結直腸癌研究的重要內容。Michael et al［3］首先報道miRNA（miR）-143與miR-145在結腸直癌中表達失調，隨后陸續發現多種miR的表達失調并參與結直腸癌的發生發展，某些miR有一定的診斷及預后價值［4］。該實驗將載有miR-200a的質粒轉染至結直腸癌SW1116細胞中，研究miR-200a對結直腸癌SW1116細胞侵襲能力和遷移能力的影響，探討其與結直腸癌臨床病理參數的關系。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑 SW1116人結直腸癌細胞系由南京醫科大學病理教研室饋贈；RPMI-1640培養液、胎牛血清和LipofectamineTM2000均購自美國Thermo Fisher Scientific Inc公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；miR提取試劑盒、miR cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR檢測試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；LightCyclerTM480熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏公司；Transwell小室購自美國Corning Costar公司；Matrigel凝膠購自美國BD公司。

1.2細胞培養與轉染 人結直腸癌細胞系（SW1116細胞）常規置于含5%滅活胎牛血清、100 μmol/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液中，于37℃、5%CO2條件下進行培養。每隔1～2 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代。之后換為不含抗生素的含5%胎牛血清的RPMI-1640基礎培養基中傳代SW1116細胞，調整細胞密度達2×105/ml，接種于6孔板中。次日進行轉染實驗，實驗分2組：實驗組（轉染5 μg Pgenesil-1-miRNA200a質粒）、細胞對照組。待SW1116細胞的融合率約90%時，將載有miR-200a的質粒加入250 μl的RPMI-1640培養液混勻，再將10 μl的LipofectamineTM2000與250 μl的RPMI-1640培養液混勻，常溫孵育20 min；之后將這兩種稀釋液溫和混勻，室溫孵育20 min，加入6孔板各孔，每組設置3個復孔。

1.3實時定量PCR法檢測結直腸癌SW1116細胞中miR-200a基因表達變化 細胞轉染成功后，收集細胞，提取總RNA，并逆轉錄為cDNA，隨后通過實時熒光定量PCR檢測實驗組中miR-200a的表達水平，miR-200a以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的表達作為內參照。miR-200a上游引物：5′-CCTACG CACAATTAACAAGCC-3′，下游引物：5′-GCCGTCTAACACTGTCTGGTA-3′，GAPDH上游引物：5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′，下游引物：5′-GAGTT-GTCATATTTCTCGTGG-3′。擴增反應的條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。分別記錄實驗組和細胞對照組的實驗結果，采用2-ΔΔCt相對定量法進行分析計算，以衡量miR-200a的表達強度，實驗重復3次。

1.4劃痕實驗檢測miR-200a對結直腸癌SW1116細胞遷移能力的影響 用Marker筆在6孔板背后均勻的劃橫線，大約每隔1 cm劃一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。在6孔板中接種轉染后24 h后的各組細胞，每組設置3個復孔，待細胞融合率達90%時，用200 μl微量移液槍頭在6孔板內垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗3遍，沖洗掉劃痕之間的細胞，之后加入無血清的RPMI-1640培養基，放入培養箱中進行培養。隨機選出10個點，分別于0 h和24 h的時候在顯微鏡下進行拍照。通過計算劃痕兩邊細胞遷移的距離來判斷結直腸癌SW1116細胞的遷移能力，實驗重復3次。

1.5Transwell小室侵襲實驗檢測miR-200a對結直腸癌SW1116細胞侵襲能力的影響 將細胞濃度調整至1×104/ml后接種于96孔板中，培養24 h后進行轉染。50 mg/L的Matrigel用不含血清的培養基1∶8稀釋，在Transwel小室的通透膜上均勻涂50 μl后4℃晾干。將轉染后24 h的200 μl的細胞懸液加入侵襲小室的上室中，并將含5%胎牛血清的RPMI-1640基礎培養基（600 μl）加入到侵襲小室的下室中。之后將小室置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。24 h后，將Matrigel凝膠和小室通透膜上方的細胞用棉簽擦去，固定侵襲到小室膜下方的細胞并用0.1%結晶紫染色，20 min后，在顯微鏡下隨機取5個視野，計數穿過通透膜的細胞個數，以穿過膜的細胞的相對個數計量結直腸癌SW1116細胞的侵襲能力，實驗重復3次。

1.6統計學處理 采用SPSS 19.0以及Excel軟件進行分析，數據以±s表示。兩組均數之間的比較采用t檢驗。

2　結果

2.1實時定量PCR法檢測結直腸癌SW1116細胞中miR-200a的表達 細胞對照組和實驗組中miR-200a的表達分別為（1.0±0.0）、（1 269.6± 441.1），實驗組中miR-200a的表達水平較細胞對照組明顯升高（t=12.383，P=0.006）；實時定量PCR法檢測表明轉染后實驗組miR-200a的表達升高。

2.2miR-200a對結直腸癌SW1116細胞遷移能力的影響 劃痕實驗后分別于0、24 h時在倒置光學顯微鏡下觀察劃痕傷口的寬度，細胞對照組和實驗組中24 h時遷移距離的百分比分別為（39.96± 2.64）%、（68.86±4.70）%，差異有統計學意義（t =6.501，P=0.023）。劃痕實驗結果表明轉染miR-200a后SW1116細胞遷移能力升高，見圖1。

圖1　miR-200a對SW1116細胞遷移力的影響A：細胞對照組；B：實驗組；1：0 h；2：24 h；與細胞對照組比較：*P＜0.05

2.3miR-200a對結直腸癌SW1116細胞侵襲能力的影響 采用Transwell小室侵襲實驗檢測miR-200a對SW1116細胞侵襲能力的影響，細胞對照組和實驗組中穿過基膜的細胞數分別為（100.0± 0.0）個和（331.33±25.03）個，差異有統計學意義（t=13.07，P=0.006）。Transwell侵襲實驗結果表明轉染miR-200a后SW1116細胞侵襲能力升高，見圖2。

3　討論

miRNAs是一組長度約為20～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，對真核生物的基因表達、細胞發育分化和個體發育等多方面起調控作用，在腫瘤的發生發展過程中，也起到非常重要的調控作用［5］。近年來，miR-200家族在調節腫瘤的進展方面受到廣泛關注，miR-200家族在上皮來源腫瘤（如消化系統腫瘤、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌等）中扮演的角色也越來越為人們所知。

圖2　miR-200a對SW1116細胞侵襲力的影響A：細胞對照組；B：實驗組；與細胞對照組比較：**P＜0.01

miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429五個成員，miR-200家族已經被證實在多種腫瘤中通過調控上皮-間質轉化影響腫瘤的進展。miR-200家族在不同的腫瘤的發生發展以及轉移中起著重要的作用，目前已有研究［6］證明miR-200家族在胃癌中表達下調，在正常組織和癌組織中的表達差異有統計學意義，亦有研究［7］表明，在奧沙利鉑抵抗的結直腸癌患者中，miR-200c和miR-141的表達是下調的，miR-200c和miR-141則被報道［8］其表達的下調可促進ZEB1/2的表達進而推動及胃癌的進展，miR-200家族在乳腺癌中的低表達與乳腺癌的淋巴結轉移息息相關。Humphries et al［9］證明miR-200b通過靶向作用于蛋白激酶Cα抑制三陰性乳腺癌的轉移。這些研究結果都表明，miR-200家族在上皮來源的腫瘤中發揮著重要作用，扮演著癌基因或者抑癌基因的角色。

然而miR-200a在結直腸癌中的作用目前仍有爭議，對其浸潤侵襲以及遠處轉移的研究尚少見，為此我們進行了這一體外實驗，通過在體外提高miR-200a的表達水平，探討其對結直腸癌SW1116細胞的遷移能力和侵襲能力的影響。本實驗采用穩定性好、操作簡便的瞬時轉染法將載有miR-200a的質粒導入SW1116細胞中，在結直腸癌SW1116細胞中高表達miR-200a作為實驗組，同時建立細胞對照組與之相比較，用實時定量PCR法結果證實SW1116細胞中miR-200a的表達。通過劃痕實驗檢測細胞的遷移能力、Transwell小室法檢驗細胞的侵襲能力，證明miR-200a的高表達促進了SW1116細胞的遷移和侵襲。說明miR-200a在結直腸癌的侵襲和轉移中起著重要作用，由此推測miR-200a在結直腸癌的侵襲以及遷移過程中可能發揮著癌基因的作用。

結直腸癌是當今世界上第三大常見癌癥，腫瘤細胞的轉移導致晚期結直腸癌患者的預后較差，然而其具體的調控機制并不十分清楚。因此，深入探索結直腸癌轉移的分子機制可以為轉移性結直腸癌的診斷和治療以及提高患者的生存率提供新思路。miRNAs可以通過其種子序列與靶基因的mRNA 3′非翻譯區（3′-UTR）結合而抑制靶基因的轉錄和翻譯。研究［10］表明，miR-200a可以通過靶向作用于EGFR以及c-Met進而抑制非小細胞肺癌的遷徙和侵襲，亦有研究［11］報道miR-200a可直接靶向作用于TGFB2，抑制腎細胞癌的發生發展，Yang et al［12］發現miR-200a通過降低ZEB2的表達，抑制肝細胞癌的轉移，說明進一步研究miRNAs及預測其靶基因對于研究其在結直腸癌的發生發展中所起的作用有重要意義，而miR-200a在抑制結直腸癌遷徙和侵襲和作用的靶基因及分子機制還不明確，因此尋找miR-200a在結直腸癌中的作用靶點是進一步研究的重要內容。

miR-200a在結直腸癌組織中呈高表達模式，miR-200a在結直腸癌SW1116細胞中表達失常［13］。本實驗進一步表明miR-200a能促進結直腸癌SW1116細胞的侵襲和遷移能力，提示miR-200a是一種重要潛在的原癌基因，在促進腫瘤增殖生長中起了不可或缺的作用，因此目前臨床上常將其作為在基因水平上治療腫瘤發生發展的重要靶點，是治療腫瘤的關鍵基因之一。研究［14］表明miR-200a和miR-200b能夠影響姜黃素在肝細胞癌中的療效，miR-200家族在肝細胞癌中已經成為通用的診斷標志，根據miR-200a在結直腸癌轉移過程中所扮演的角色可以為未來開展結直腸癌治療提供新思路，即通過下調miR-200a的表達從而抑制結直腸癌的轉移。

結合以往的研究、文獻報道及本實驗結果綜合考慮，miR-200a與結直腸癌的發生和發展息息相關。本研究結果進一步證實miR-200a在人結直腸癌的侵襲和轉移起促進作用，可能是調控結直腸癌細胞侵襲和遷移的關鍵miR之一。這為結直腸癌臨床基因治療提供了新的思路和理論依據。然而對于miR-200a還有許多問題需要進一步研究，如miR-200a對結直腸癌SW1116細胞影響的確切作用機制及作用途徑，miR-200a與其他和結直腸癌相關的基因相互作用的關系，以及和miR-200a相關的體內實驗是不是能得到相同的結論等，因此對于miR-200a的研究仍有廣闊的前景和巨大的空間，需要不斷地努力探索和開拓。

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Effect of miR-200a on the migration and invasion of colorectal cancer SW1116 cells

Li Yijun，Li Hao，Yin Yu，et al
（Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effect of microRNA（miR）-200a on migration and invasion abilities of colorectal cancer SW1116 cells.Methods miR-200a plasmid was transfected into SW1116 cells in colorectal cancer SW1116 cells by LipofectamineTM2000 as the experimental group，colorectal cancer SW1116 cells in the control group do not do any processing.The expression of miR-200a in the experimental group was confirmed by real-time PCR.The migration abilities of cells were detected by Transwell invasion assay，and the invasion abilities of cells were detected by wound-healing assay.Results Real-time quantitative PCR results showed that compared with the control group，experimental group after transient transfection of miR-200a was significantly increased（P＜0.01）.Exogenous overexpression of miR-200a could promote migration and invasion abilities of SW1116 cells，compared with the control group the difference was statistically significant（P＜0.01）.Conclusion miR-200a can promote the migration and invasion abilities of colorectal cancer SW1116 cells.

colorectal cancer；miR-200a；migration；invasion

R 735.3

A

1000-1492（2016）06-0791-04

2016-04-14接收

國家自然科學基金（編號：81201536）；安徽高校省級自然科學基金（編號：KJ2011A160）

安徽醫科大學病理學教研室，合肥 230032

李懿君，女，碩士研究生；李 昊，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：lihao3402@aliyun.com；尹 玉，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：aydyinyu@aliyun.com