線栓法及結(jié)扎法制作大鼠下肢缺血模型的比較

王　芳，劉盛智，賴　坤，周翔宇

線栓法及結(jié)扎法制作大鼠下肢缺血模型的比較

王芳，劉盛智，賴?yán)ぃ芟栌?/p>

用線栓和結(jié)扎股動脈兩種方法制備SD大鼠下肢缺血模型，通過多普勒激光掃描記錄各組雙下肢血流灌注值（PU），取大鼠雙后肢腓腸肌及線栓處股動脈進行HE染色；手術(shù)側(cè)腓腸肌，采用Western blot法檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（CD31）。結(jié)果顯示，結(jié)扎組的組織炎癥、水腫發(fā)生時間較線栓組提前，而組織血流灌注在第49天時兩組并無太大差異，結(jié)扎組的VEGF和CD31變化時間均比線栓組提前，但兩者的變化趨勢是一樣的，在第49天時除線栓組CD31外，均可恢復(fù)正常水平。長時間觀察兩種模型并沒有太大差異，故兩種方法都可制作慢性下肢缺血模型。

結(jié)扎法；線栓法；下肢缺血模型

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-9 15：43：11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.072.html

隨著人們生活水平的日益提高、飲食結(jié)構(gòu)及人口老齡化等因素的改變，外周動脈疾病（peripheral artery disease，PAD）的發(fā)病率和死亡率逐年增加。對下肢缺血性疾病發(fā)生發(fā)展過程及其治療手段的探索顯得尤為迫切，而建立適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ褪茄芯肯轮毖约膊〉幕A(chǔ)。目前用得最多的方法是外周動脈結(jié)扎法以及血管栓塞法，該研究就線栓法和結(jié)扎法兩種方式制作大鼠下肢缺血模型并對其缺血效果進行比較。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器 SD大鼠，雄性，63只，190～240 g，平均225 g，購自四川醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，隨機分為對照組（21只）、線栓組（21只）、結(jié)扎組（21只）。moorLDI2-HIR激光多普勒血流儀購自英國Moor Instruments公司；手術(shù)顯微鏡及顯微手術(shù)器械購自重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）抗體購自英國Abcam公司。

1.2實驗方法 模型制作前準(zhǔn)備：大鼠常規(guī)飲食，提前1 d用1%戊巴比妥鈉（30～50 mg/kg）腹腔麻醉后用寵物剃毛器將大鼠下腹部及雙下肢毛發(fā)剔除，再用10%的硫化鈉祛除殘余毛發(fā)。

1.2.1動脈結(jié)扎組（結(jié)扎組）模型的制作 用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，術(shù)前行激光多普勒掃描后仰臥固定，左后肢常規(guī)消毒鋪巾，在左側(cè)腹股溝部作縱形切口，分離暴露股動脈，范圍從腹股溝韌帶至隱動脈、腘動脈分叉處。于腹股溝韌帶處雙重結(jié)扎股動脈主干，遠(yuǎn)端結(jié)扎隱動脈、腘動脈等分支，術(shù)畢，縫合切口。

1.2.2動脈線栓組（線栓組）模型的制作 麻醉方法、切口位置及股動脈分離同上，于腹股溝韌帶處分離股動脈主干后放入微型血管夾阻斷血流，用顯微剪在手術(shù)顯微鏡下于股動脈前壁開一小口，向遠(yuǎn)端插入1 cm長4-0的鎳鈦記憶合金縫線。用10個0的手術(shù)縫線縫合股動脈切口，松開血管夾，見無活動性出血后縫合切口。

1.2.3對照組 麻醉方法、切口位置及股動脈分離同上，分離后的股動脈不做任何處理，隨后縫合切口。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1后肢血流量測定 術(shù)前、術(shù)后立即、術(shù)后3、7、14、21、28、35、42、49 d對3組大鼠常規(guī)麻醉后，于相對恒定的26℃室溫下，行多普勒激光掃描記錄雙側(cè)血流灌注（perfusion unite，PU）值。比較3組SD大鼠手術(shù)側(cè)（左側(cè)）與非手術(shù)側(cè)（右側(cè)）肢體的PU比值。

1.3.2組織學(xué)檢查 HE染色：于術(shù)后7、14、21、28、35、42、49 d行激光多普勒掃描后處死各組大鼠，取大鼠雙后肢腓腸肌及線栓處股動脈，采用甲醛固定、石蠟包埋，用作HE染色。

1.3.3提取蛋白 取適當(dāng)組織液氮研磨，按組織∶PMSF∶RIPA=1 mg∶0.1 μl∶10 μl的比例加入EP管中冰上裂解，超聲、離心（4℃、12 000 r/min離心10 min），吸上清液，測蛋白濃度，加入loading buffer，沸水浴5 min。

1.3.4Western blot法檢測 樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，敷一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10min，暗室曝光、顯影、定影。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，采用兩獨立樣本t檢驗進行分析。

2　結(jié)果

2.1組織學(xué)結(jié)果

2.1.1腓腸肌組織HE染色結(jié)果 線栓組：術(shù)后14 d細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常染色均勻，術(shù)后28 d可見細(xì)胞染色不均，有炎細(xì)胞浸潤，第49天可見少量纖維結(jié)締組織增生。結(jié)扎組：術(shù)后14 d細(xì)胞腫脹染色不均，原有形態(tài)改變，術(shù)后21 d見大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞形態(tài)變圓，術(shù)后28 d可見纖維結(jié)締組織增生，第49天見大量纖維結(jié)締組織增生。各組大鼠右側(cè)側(cè)腓腸肌組織形態(tài)改變不明顯。

2.1.2線栓組血管HE染色 術(shù)后14 d線栓處血管的組織結(jié)構(gòu)保持完好，無內(nèi)膜增生，未見血栓。術(shù)后21 d見血管內(nèi)膜開始增生，術(shù)后28 d血管內(nèi)膜大量增生，幾乎完全堵塞血管。

圖1　腓腸肌和線栓組血管HE染色A：線拴組術(shù)后14 d腓腸肌 ×400；B：線拴組術(shù)后28 d腓腸肌×400；C：線拴組術(shù)后49 d腓腸肌 ×200；D：結(jié)扎組術(shù)后14 d腓腸肌 ×400；E：結(jié)扎組術(shù)后28 d腓腸肌 ×400；F：結(jié)扎組術(shù)后49 d腓腸肌 ×200；G：線栓組術(shù)后14 d線栓處血管 ×100；H：線栓組術(shù)后21 d線栓處血管 ×100；I：線栓組術(shù)后28 d線栓處血管×100

2.2激光多普勒血流成像儀檢測雙下肢血流灌注

與術(shù)前（圖2A）比較，線栓組術(shù)后患側(cè)血流減少不明顯（圖2B），結(jié)扎組術(shù)后血流明顯減少（圖2C）。對照組在整個過程中血流PU值（左側(cè)/右側(cè)）變化不明顯。結(jié)扎組和線栓組均在術(shù)后達(dá)到最低值（0.509 4±0.046 0 vs 0.678 5±0.072 6），P＜0.001）隨后逐漸升高，術(shù)后7 d內(nèi)血流恢復(fù)較快，術(shù)后3 d和7 d結(jié)扎組血流分別恢復(fù)到原來的79.6%、94.1%，線栓組血流分別恢復(fù)到原來的84.8%、87.2%，其中結(jié)扎組血流恢復(fù)速度快于線栓組，術(shù)后7～49 d血流恢復(fù)較緩慢，術(shù)后49 d兩組血流分別為原來的103.5%、95.8%（圖2D）。

圖2　激光多普勒血流成像儀監(jiān)測雙下肢血流灌注A：術(shù)前兩側(cè)下肢血流灌注；B：線栓組術(shù)后血流灌注；C：結(jié)扎組術(shù)后血流灌注；D：三個組各時間點的PU比值（左/右），其中1～10分別代表術(shù)前、術(shù)后立即、術(shù)后3 d、術(shù)后7 d、術(shù)后14 d、術(shù)后21 d、術(shù)后28 d、術(shù)后35 d、術(shù)后42 d、術(shù)后49 d；與結(jié)扎組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

2.3Western blot檢測結(jié)果 VEGF：結(jié)扎組從第1周開始依次減少，第3周含量最低，然后逐漸升高，第6周回到正常水平。線栓組含量從第3周開始減少，第5周時最低，第7周回到正常水平。CD31：結(jié)扎組前3周含量較正常水平低，第4周時增高，隨后依次降低，7周時恢復(fù)正常水平。線栓組從第2周到第4周含量依次減少，第5周時增高，第5周到第7周逐漸降低。見圖3。

3　討論

圖3　Western blot法檢測結(jié)扎組和線栓組1～7周各時間點的VEGF和CD31的變化情況A：術(shù)前；B：術(shù)后1周；C：術(shù)后2周；D：術(shù)后3周；E：術(shù)后4周；F：術(shù)后5周；G：術(shù)后6周；H：術(shù)后7周

世界范圍由PAD導(dǎo)致患者截肢率逐年增加［1-2］，尋找切實可行擬人性好的動物研究模型，才能使基礎(chǔ)實驗轉(zhuǎn)化為臨床所用。自1987年Couffinhal et al通過結(jié)扎小鼠股動脈及各分支成功建立了后肢缺血模型后又將實驗對象擴展到Wistar大鼠、SD大鼠等其他鼠類動物［3］。隨后在不斷探索中，有人指出這種模型的病理生理和組織恢復(fù)情況與臨床上PAD患者不同，血管的急性阻塞會立即導(dǎo)致血管的應(yīng)答，會強有力的刺激側(cè)支生長［4］，于是研究者們開始探索新的造模方法，出現(xiàn)了以縮窄器［4-5］、各種栓塞微粒［3，6］、介入［7-8］、線栓［9］等栓塞法逐步阻斷血流的方式，但目前各種方式仍處于探索之中，并沒有得到國際公認(rèn)。

本實驗選擇結(jié)扎和線栓股動脈兩種方法，研究其在大鼠下肢長期缺血過程中是否有差異，以制備更好的下肢缺血動物模型。HE染色顯示，結(jié)扎組腓腸肌組織的細(xì)胞腫脹和炎細(xì)胞浸潤發(fā)生時間都比線栓組早而且更嚴(yán)重，在長時間觀察中纖維結(jié)締組織增生也更明顯。同時血管慢性阻塞過程使組織有時間來適應(yīng)缺血，所以不會造成嚴(yán)重的組織損傷。激光多普勒動態(tài)監(jiān)測皮膚微循環(huán)血流量顯示兩組的PU值均在術(shù)后達(dá)到最低值，1周后并無太大差異，兩者的變化時間點差不多一致。VEGF為血管內(nèi)皮生長因子，是最有效的促血管生長因子。CD31為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，兩者都可用于評估血管生成。兩組的VEGF和CD31變化趨勢是相似的，但結(jié)扎組兩個指標(biāo)的改變時間均較線栓組提前，說明結(jié)扎組側(cè)支循環(huán)的建立要比線栓組快，有研究［5，7］指出這可能和血管剪應(yīng)力和炎癥細(xì)胞的浸潤有關(guān)系。試驗中除了線栓組的CD31外，其他因子都能在7周的時間內(nèi)達(dá)到正常水平，證明兩種方法在長時間缺血上并無太大差異。

通過對各研究的觀察顯示，采用不同的栓塞材料［6-7］栓塞股動脈，最后導(dǎo)致的組織學(xué)、組織因子、激光多普勒的變化都有一定差異，這也可能是栓塞法沒有得到國際認(rèn)可的原因。而結(jié)扎法中結(jié)扎血管的范圍不同最后的缺血效果也不相同［6，10-12］。綜上所述，兩種方法都可以制備下肢缺血動物模型，一段時間內(nèi)肢體缺血程度、組織學(xué)和組織因子的改變有一定差異，但在較長時間監(jiān)測中，兩組差異并不是很明顯。故兩種方法均可用于制備慢性肢體缺血，但結(jié)扎法的操作性、可控性明顯優(yōu)于線栓法。

［1］ Zudin A M，Zasorina M A，Orlova M A.Epidemiology of chronic critical limb ischemia［J］.Khirurgiia（Mosk），2014，10：78-82.

［2］ Baltgalvis K A，White K，Li W，et al.Exercise performance and peripheral vascular insufficiency improve with AMPK activation in high-fat diet-fedmice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，306（8）：H1128-45.

［3］ 鄒知耕，田 鏵，趙世剛，等.自體血栓并股動脈結(jié)扎建立有效的大鼠后肢缺血模型［J］.解剖學(xué)雜志，2011，34（5）：718-20.

［4］ Dragneva G，Korpisalo P，Yl?-Herttuala S.Promoting blood vessel growth in ischemic diseases：challenges in translating preclinical potential into clinicalsuccess［J］.Dis Model Mech，2013，6（2）：312-22.

［5］ Yang Y，Tang G，Yan J，et al.Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral arteryocclusion are distinct in the mouse［J］.J Vasc Surg，2008，48（6）：1546-58.

［6］ Shin C I，Kim H C，Song Y S，et al.Rat model of hindlimb ischemia induced via embolization with polyvinyl alcohol and N-butyl cyanoacrylate［J］.Korean J Radiol，2013，14（6）：923-30.

［7］ Zhuang Z W，Shi J，Rhodes J M，et al.Challenging the surgical rodent hindlimb ischemia model with the miniinterventional technique［J］.J Vasc Interv Radiol，2011，22（10）：1437-46.

［8］ Korosoglou G，Gilson W D，Sch?r M，et al.Hind limb ischemia in rabbit model：T2-prepared versus time-of-flight MR angiography at 3T［J］.Radiology，2007，245（3）：761-9.

［9］ 盛楊家，陳 兵，羅 濤，等.Lewis大鼠慢性后肢缺血模型的制備與評價［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2012，19（12）：1291-7.

［10］Ziegler M A，Distasi M R，Bills R G，et al.Marvels，mysteries，and misconceptions of vascular compensation to peripheral artery occlusion［J］.Microcirculation，2010，17（1）：3-20.

［11］Paek R，Chang D S，Brevetti L S，et al.Correlation of a simple direct measurement of muscle pO（2）to a clinical ischemia index and histology in a rat model of chronic severe hindlimb ischemia［J］.J Vasc Surg，2002，36（1）：172-9.

［12］Yang Z，von Ballmoos M W，Diehm N，et al.Call for a reference model of chronic hind limb ischemia to investigate therapeutic angiogenesis［J］.Vascul Pharmacol，2009，51（4）：268-74.

Comparison between ligation and suture-occlusion to establish hind-limb ischiemia model in rats

Wang Fang，Liu Shengzhi，Lai Kun，et al
（Dept of Vascular and Thyroid Surgery，The First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，Luzhou 646000）

Male SD rats were divided into ligation induced hind-limb ischemia group，suture-occlusion induced hind-limb ischemia group，sham operation group respectively.Ligation group was subjected to ligate the femoral artery，the occlusion group was occluded the femoral artery by suture.The laser Doppler imager was performed to evaluate the blood flow at different time points after operation.Then，the rats were sacrificed and the gastrocnemius and vessel were achieved to be further examined after angiography.Western blot was used to detect the protein expression of VEGF and CD31.Typical pathological manifestation of hind-limb ischemia was found in both experimental models，such as inflammation infiltration，edema and muscle fibrosis.There was no obvious difference of the blood flow in the two experimental groups.Western blot results showed that the protein expressions of VEGF and CD31 were decreased at early time of ischima，then gradually restored till on the 49th day，which indicated that similar proteins changes happened in two ischima groups.There was no obvious difference in two ischemia models，so the two methods could be used to induce chronic hind-limb ischemia animal model successfully.

ligation；embolization；hindlimb；ischemia model

R 654.4

A

1000-1492（2016）06-0913-04

2016-03-04接收

四川省衛(wèi)生計生委2014年科研基金（編號：140035）

四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管甲狀腺外科，瀘州646000

王 芳，女，碩士研究生；周翔宇，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xiangyuzhou971@163.com