雷公藤多苷干預舒尼替尼引起的小鼠腎足細胞凋亡及相關蛋白表達的機制研究

江　超，陳映霞，秦叔逵，楊愛珍，馬興群，成　遠，曹夢苒，聞　妹

雷公藤多苷干預舒尼替尼引起的小鼠腎足細胞凋亡及相關蛋白表達的機制研究

江超1，陳映霞1，秦叔逵1，楊愛珍2，馬興群1，成遠1，曹夢苒1，聞妹1

目的 觀察舒尼替尼對體外培養小鼠腎足細胞的影響，并探討雷公藤多苷（TWP）對舒尼替尼所致小鼠腎足細胞損傷的保護作用及其機制。方法 體外培養小鼠腎足細胞，不同分組給藥處理后，采用MTT法、流式細胞術、Western blot法檢測小鼠腎足細胞的增殖抑制率、凋亡率及相關蛋白（Nephrin、CD2AP）的表達情況。結果 小鼠腎足細胞增殖抑制率隨著舒尼替尼濃度及作用時間的增加而增加（P＜0.01）；48 h凋亡率隨舒尼替尼濃度增加而增加（P＜0.01）。TWP可降低48 h舒尼替尼引起的小鼠腎足細胞增殖抑制率和凋亡率（P＜0.05），同時可抑制舒尼替尼引起的Nephrin、CD2AP表達量降低（P＜0.05）。結論 舒尼替尼可損傷小鼠腎足細胞；而TWP通過上調Nephrin、CD2AP蛋白表達減輕舒尼替尼導致的足細胞損傷。

舒尼替尼；抗血管生成；雷公藤多苷；小鼠腎足細胞；蛋白尿

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.018.html

舒尼替尼是一種口服的小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能抑制多個在腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖中起到了關鍵作用的酪氨酸激酶［1］，因此具有抗血管生成和抗腫瘤作用。然而，研究［2］顯示服用道舒尼替尼的患者蛋白尿的發生率為21%～63%，在晚期腎癌患者中發生嚴重蛋白尿的比例達6.5%。雷公藤多苷（Tripteryium wilfordii polyglycosidium，TWP）是從雷公藤植物根中提取的總苷，包括雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤紅素等，具有抗炎、免疫抑制等作用［3］。臨床上TWP可用于治療多種原發性及繼發性腎小球疾病。動物實驗［4］顯示TWP通過改善腎小球裂孔膜（slit diaphragm，SD）相關蛋白的表達，保護足細胞，減少蛋白尿。該研究通過觀察舒尼替尼對體外培養的小鼠腎足細胞生物學活性的影響，探索抗血管生成藥物引起蛋白尿形成的可能機制；并探討TWP是否具有保護舒尼替尼導致足細胞損傷的作用。

1　材料與方法

1.1細胞株與試劑 小鼠腎足細胞購自北京協和細胞中心。主要試劑：舒尼替尼購自美國輝瑞公司；雷公藤多苷購自浙江得恩德制藥有限公司；DMEM（高糖）培養基、胎牛血清、雙抗、0.25%胰酶（含EDTA）購自美國Thermo公司；重組小鼠γ-干擾素（interferon，IFN-γ）購自美國PEPROTECH公司；MTT購自美國Sigma公司；Annexin-V APC/7-AAD雙染凋亡試劑盒、RIPA裂解液（含1 mmol/L PMSF）購自南京凱基生物科技公司；兔抗小鼠Nephrin一抗、兔抗小鼠CD2AP一抗購自美國Abcam公司；羊抗兔IgG-HRP、GAPDH一抗購自南京凱基生物科技公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 小鼠腎足細胞復蘇，未分化細胞用含10%胎牛血清（FPS）、10 U/ml重組小鼠IFN-γ、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素DMEM（高糖）培養基在33℃、5%CO2的培養箱中培養。傳代后將細胞在37℃、不含重組小鼠IFN-γ的其他條件相同的環境下誘導分化2周，待細胞呈對數生長期時待用。

1.2.2MTT比色法檢測 取生長良好的對數期小鼠腎足細胞，0.25%胰酶（含EDTA）消化，用含血清的培養基配成細胞懸液，計數。將細胞以4×104個/ml接種于96孔板內，每孔100 μl，24 h后棄掉上清液，分別加入含藥且無血清培養基，根據藥物濃度分組為：空白對照組、舒尼替尼（1、2、3、4、5 μmol/ L）組、TWP 40 ng/ml組及TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組，每組設4個平行孔。TWP濃度根據參考文獻及預實驗確定，舒尼替尼3 μmol/L接近于該藥作用于足細胞48 h的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。培養24、48、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續培養4 h，棄上清液，每孔加200 μl DMSO，避光振蕩10 min，用全自動酶聯免疫檢測儀測定在570 nm下各孔的吸光度（absorbance，A）值，并計算各組細胞的增殖抑制率。采用藥物相互作用指數（coefficient of drug interaction，CDI）反映舒尼替尼和雷公藤多苷兩藥相互作用性質。CDI值計算如下：CDI=AB/（A× B）；AB為兩藥聯用組與空白對照組A值的比值，A或B是各藥物單獨使用組與空白對照組A值的比值。如CDI＜0.9，表示兩藥作用性質為協同；CDI 0.9～1.1，表示兩藥性質為相加；CDI＞1.1，表示兩藥作用性質為拮抗（本文中A藥代表舒尼替尼，B藥代表雷公藤多苷）。

1.2.3流式細胞術檢測 取生長良好的對數期小鼠腎足細胞，消化、計數（同前），后以1×106個每孔接種于6孔板中，24 h后棄上清液，分別加入含藥的無血清培養基，分組為空白對照組、不同濃度舒尼替尼（1、3 μmol/L）組、TWP 40 ng/ml組、TWP（40 ng/ ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組；繼續培養48 h后收集上清液，PBS洗3次，收集非貼壁細胞。用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集貼壁細胞，將每孔的非貼壁細胞和貼壁細胞混合，2 000 r/min離心5 min后用PBS洗滌重懸細胞再次離心，共洗滌2次。收集5×105個細胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-APC混勻后，加入5 μl 7-AAD，混勻，室溫、避光、反應10 min，用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.2.4Western blot法檢測 將生長良好對數期小鼠足細胞接種于6孔板內（同流式細胞術）。細胞分組為空白對照組、舒尼替尼3 μmol/L組、TWP 40 ng/ml組、TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組，加藥后培養48 h。收集每孔內所有細胞（包括上清液中及貼壁細胞），用預冷PBS洗滌后離心（2 000 r/min、5 min）2次，每孔加入含1 mmol/L PMSF的RIPA細胞裂解液150 μl裂解提取細胞總蛋白，4℃、12 000 r/min離心5 min后取上清液；用BCA蛋白定量試劑盒檢測每孔蛋白濃度；取等量40 μg總蛋白質經8%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉移至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉2 h，分別用兔抗小鼠Nephrin、兔抗小鼠CD2AP一抗（按照1∶400稀釋），GAPDH一抗（按照1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再用按照1∶200稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；ECL試劑發光、顯影。使用Tanon MP-FLI Capturer軟件成像，Tanon Gel Image System軟件對結果進行灰度值分析。結果以目標蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值表示。

1.3統計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行分析，數據±s表示。不同藥物分組之間增殖抑制率、凋亡率及相關蛋白表達量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2　結果

2.1不同組小鼠腎足細胞的增殖抑制率 不同濃度舒尼替尼作用24、48、72 h后，小鼠腎足細胞增殖抑制率隨著藥物濃度及作用時間的增加而增高（F =133.824，P＜0.01），呈現濃度依賴性和時間依賴性；TWP具有微弱細胞增殖抑制作用，但隨時間增加差異無統計學意義；TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組與相同濃度舒尼替尼單藥組比較，48 h抑制率降低（F=45.209，P＜0.01），而24、72 h差異無統計學意義。48 h組CDI＞1.1，說明在48 h組舒尼替尼與TWP作用性質為拮抗，見表1。

2.2不同組小鼠腎足細胞調亡率 采用流式細胞術檢測不同分組給藥48 h后，舒尼替尼1、3 μmol/L組凋亡率分別為（8.98±0.135）%、（47.04±2.180）%，高于空白對照組（5.92±0.125）%；且舒尼替尼3 μmol/L組高于舒尼替尼1 μmol/L組（P＜0.01）。TWP 40 ng/ml組凋亡率為（4.46±0.32）%，與空白對照組比較差異無統計學意義。TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組凋亡率低于同等劑量舒尼替尼組（P＜0.01），見圖1。

表1　不同藥物分組小鼠腎足細胞的增殖抑制率（%，n=4，±s）

表1　不同藥物分組小鼠腎足細胞的增殖抑制率（%，n=4，±s）

與24 h比較：*P＜0.01；與48 h比較：#P＜0.01；與相同時間舒尼替尼1 μmol/L組比較：ΔP＜0.01；與相同時間舒尼替尼2 μmol/L組比較：▽P＜0.05；與相同時間舒尼替尼3 μmol/L組比較：▲P＜0.05；與相同時間舒尼替尼4 μmol/L組比較：▼P＜0.05

組別抑制率24 h48 h72 h舒尼替尼1 μmol/L3.67±1.4517.65±7.47*42.09±3.23*#58.18±1.56舒尼替尼2 μmol/L12.04±2.44Δ35.73±1.87*Δ54.14±1.87*#Δ舒尼替尼3 μmol/L23.62±3.64▽46.05±3.92*▽61.06±1.29*#▽舒尼替尼4 μmol/L34.17±5.86▲52.23±3.56*▲69.69±1.91*#▲舒尼替尼5 μmol/L41.40±2.93▼61.02±3.70*▼73.92±2.38*#▼TWP 40 ng/ml8.37±2.372.09±8.641.44±4.18 TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）16.74±5.5126.51±3.83▲

2.3不同分組給藥對小鼠腎足細胞蛋白Nephrin、CD2AP表達水平的影響 給藥48 h后，舒尼替尼（3 μmol/L）組小鼠腎足細胞蛋白Nephrin、CD2AP表達較對空白對照組降低（FNephrin=47.035、FCD2AP=20.856，P＜0.01）；TWP 40 ng/ml組Nephrin、CD2AP蛋白與空白對照組比較差異無統計學意義；而TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組較舒尼替尼3 μmol/L組增高（FNephrin=16.910、FCD2AP= 12.493，P＜0.05）。見圖2、表2。

圖1　不同分組給藥48 h后小鼠腎足細胞凋亡情況A：空白對照組；B：舒尼替尼1 μmol/L組；C：舒尼替尼3 μmol/L組；D：TWP 40 ng/ml組；E：TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組

3　討論

蛋白尿是抗血管生成藥物常見毒副作用，多為無癥狀性［2］，腎活檢病理無顯著改變。少部分患者在服藥期間會出現大量蛋白尿，并伴有不可逆性腎功能損傷［5］。在服用舒尼替尼期間，當24 h尿蛋白大于3.0 g時需要中斷治療，直至低于該標準后，方可繼續治療，而達到腎性蛋白尿時，則推薦永久性停藥［6］，這將導致有效治療中斷。抗血管生成藥物所致蛋白尿的發生可能涉及多個機制［7］，包括干擾足細胞源性血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、下調足細胞連接蛋白、改變腎小球血流動力學、引起亞急性腎小球血栓性微血管病變等。如伴糖尿病等基礎疾病或合并使用腎毒性藥物蛋白尿發生率較高。

圖2　不同分組給藥48 h后各組Nephrin、CD2AP蛋白的表達情況A：空白對照組；B：舒尼替尼3 μmol/L組；D：TWP 40 ng/ml組；E：TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組

表2　不同分組給藥48 h后，各組Nephrin、CD2AP蛋白相對表達量（±s）

表2　不同分組給藥48 h后，各組Nephrin、CD2AP蛋白相對表達量（±s）

與空白對照組比較：*P＜0.01；與TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組比較：#P＜0.05

組別CD2AP/GAPDHNephrin/GAPDH空白對照0.820±0.0360.796±0.045舒尼替尼3 μmol/L0.577±0.085*#0.530±0.050*#TWP 40 ng/ml0.866±0.0760.788±0.079 TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）0.783±0.0550.683±0.041

足細胞和足突相互交錯構成的SD作為腎小球濾過膜的關鍵部分，參與了腎小球濾過膜機械和電荷屏障的建立。足細胞是一種終末分化細胞，再生能力有限［8］，一旦受損必將導致腎小球濾過膜的破壞，血液中大分子蛋白濾過，形成蛋白尿。本實驗結果顯示，舒尼替尼在體外可抑制小鼠腎足細胞增殖，呈現劑量依賴性和時間依賴性；且舒尼替尼能誘導小鼠腎足細胞凋亡。提示抗血管生成劑相關蛋白尿發生的機制與小鼠腎足細胞受損相關。

Nephrin是第1個被發現的由足細胞產生特異性表達于SD上的跨膜蛋白，是引起先天性腎病綜合癥（芬蘭型）的致病基因的產物［9］，是一種信號受體分子，其胞內區的酪氨酸磷酸化而起到信號傳導作用。同時還維持著SD的完整性和足細胞的正常形態及功能。CD2AP在腎臟主要由足細胞產生，是一種胞質蛋白，具有信號傳導和介導蛋白相互作用的功能。CD2AP在足細胞中與其他的SD分子Nephrin、Podocin形成復合體，維持足細胞裂孔膜的結構和正常功能［10］。因此Nephrin、CD2AP在維持足細胞生理功能、腎小球濾過屏障的完整和蛋白尿的產生中起到重要作用。研究［11］顯示，拮抗VEGF或VEGFR均可導致腎小管內皮細胞增生、肥大，細胞連接松散，其原因與足細胞上Nephrin蛋白表達下調有關。本實驗結果顯示，舒尼替尼可降低小鼠腎足細胞SD關鍵蛋白Nephrin、CD2AP的表達，這將導致腎小球SD結構和功能的完整性被破壞。這可能是舒尼替尼等抗血管生成藥物導致蛋白尿發生的重要機制。

研究［4，12］顯示，TWP對一些大鼠腎病模型中足細胞具有保護作用，并可上調Nephrin、Podocin、CD2AP等足細胞SD蛋白的表達，從而改善足細胞病變減少尿蛋白。本研究顯示，TWP對舒尼替尼導致的小鼠足細胞的增殖抑制及細胞凋亡有改善作用。采用TWP干預時，可上調SD關鍵蛋白Nephrin、CD2AP的表達。提示TWP可能對抗血管生成劑所致蛋白尿具有一定的預防和治療價值。

研究［13］顯示，雷公藤中二萜類化合物具有廣譜抗癌活性，且其中的有效成分如雷公藤內酯醇可通過抑制Toll樣受體4和核因子-κB（TLR4/NF-κB）信號通路、下調基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。研究［14］顯示，TWP中有效成分雷公藤紅素可抑制腫瘤血管生成。因此TWP與舒尼替尼等抗血管生成藥物聯合使用，除了可改善其導致的腎足細胞的損傷外，是否具有一定的協同抗腫瘤、抗血管形成效應，值得進一步研究。雷公藤制劑早先被認為是一種免疫抑制劑，近年研究［15］顯示其具有雙相免疫調節作用，另外還具有肝腎、生殖系統等毒性。在與抗腫瘤藥物、抗血管形成藥物聯合應用時，其如何影響免疫功能，其他毒性是否會疊加，均需要進行深入細致的研究。

綜上所述，舒尼替尼在體外可損傷小鼠腎足細胞，下調其SD關鍵蛋白Nephrin、CD2AP的表達。TWP通過上調Nephrin、CD2AP蛋白的表達同時改善舒尼替尼導致的足細胞損傷。下一步將進行動物實驗驗證本研究結果，為進一步臨床應用提供依據。

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Research on the mice podocyte apoptosis and expression of the associated protein caused by TWP intervene sunitinib

Jiang Chao，Chen Yingxia，Qin Shukui，et al
（Dept of Medical Oncology，81st Clinical Medical College of Anhui Medical University，Nanjing 210002）

Objective To observe the effect of sunitinib culturing mice podocyte in vitro，moreover，probe into the protective effect of Tripterbium wilfordii polyglycosidium（TWP）to the cell trauma which caused by sunitinib and its mechanisms.Methods Cultured mice podocyte in vitro，after given medicine to different groups，detected the proliferation inhibiting rate，apoptosis rate and the expression status of the mice podocyte related protein（Nephrin，CD2AP）by MTT，FCM and Western blot methods.Results The proliferation inhibition rate of the mice podocyte was increased with the increasing of sunitinib dose and treated time（P＜0.01）.The apoptosis rate of mice podocyte increased with the increasing of the dose of sunitinib at 48 h（P＜0.01）.TWP could decrease the proliferation inhibition and apoptosis of the mice podocyte which caused by sunitinib at 48 h（P＜0.05），at the same time it could inhibit the decrease of the mice podocyte related protein（Nephrin，CD2AP）expression which caused by sunitinib（P＜0.05）.Conclusion Sunitinib can damnify mice podocyte，but TWP can induce the mice podocyte cell trauma caused by sunitinib through up-regulating Nephrin and CD2AP expression.

sunitinib；anti-angiogenesis；Tripterygium wilfordii polyglycosidium；mice podocyte；proteinuria

R 73-34

A

1000-1492（2016）06-0800-05

2016-03-04接收

南京軍區重點課題基金項目（編號：14ZD21）

安徽醫科大學解放軍八一臨床學院1腫瘤內科、2中心實驗室，南京 210002

江 超，男，碩士研究生；陳映霞，女，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：chenyingxiacsco@163.com