碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制及分子流行病學研究

儲雯雯，劉　周，楊　凱，管世鶴

碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制及分子流行病學研究

儲雯雯，劉周，楊凱，管世鶴

目的 探討臨床分離的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥基因及分子流行病學研究。方法 收集并鑒定臨床分離非重復碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌株44株。采用Vitek 2 compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀鑒定進行常規藥敏試驗，改良Hodge試驗檢測KPC型碳青霉烯酶，EDTA協同法檢測金屬β-內酰胺酶，聚合酶鏈反應（PCR）法檢測細菌攜帶的耐藥基因。腸桿菌基因間重復性共有序列ERIC-PCR對菌株進行同源性分析，了解其分子流行病學特征。結果44株肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗菌藥物顯示了較高的耐藥性。改良Hodge試驗陽性41株，金屬酶檢測試驗結果均為陰性。PCR結果顯示，臨床分離的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌以KPC-2型為主，共42株。ERIC-PCR將44株肺炎克雷伯菌分為14型，以Ⅰ型為主，共18株，集中于重癥監護室（ICU）和神經外科。結論分離的碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌對臨床常用抗菌藥物表現出高水平耐藥；其耐藥機制主要是該類細菌產KPC-2碳青霉烯酶，ICU與其它科室的患者頻繁轉診治療可能是導致碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌在全院范圍播散流行的主要原因。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；ERIC-PCR；KPC-2

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.022.html

肺炎克雷伯菌作為在臨床常見的院內感染致病菌之一，主要引起肺炎、敗血癥、尿路炎癥等疾病，現在臨床治療產ESBL及多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的首選藥物是碳青霉烯類抗生素，但是近年來因為碳青霉烯類抗生素泛濫性的應用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP）的比例逐漸增高，呈全球播散趨勢，成為臨床抗感染治療的嚴重威脅［1-2］。尤其在我國，CRKP分離率更是逐年攀升，正在以極其迅猛的速度流行，而導致其廣泛播散的主要原因則是碳青霉烯酶可廣泛水解包括碳青霉烯類抗生素在內的所有β-內酰胺類抗生素，并且因為可以被質粒攜帶而導致大范圍的流行［3］，在對臨床治療帶來極大挑戰的同時也給臨床耐藥方面帶來了嚴重的問題。該研究在深入了解CRKP中碳青霉烯酶的分布情況、耐藥機制及其分子流行病學特征的基礎上，根據其同源性分析院內感染流行現狀，為有效控制CRKP的流行提供科學的理論依據。

1　材料與方法

1.1菌株來源 收集2013年2月～2015年6月安徽醫科大學第二附屬醫院臨床標本中分離的非重復CRKP 44株。菌株經Vitek 2 compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀鑒定及藥敏試驗，按美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）2013版標準判定，篩選出對碳青霉烯類藥物非敏感菌。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705和ATCCBAA-1706購自衛生部臨床檢驗中心。金屬酶陽性菌株為產IMP-1型金屬酶的銅綠假單胞菌。

1.2儀器與試劑 全自動微生物鑒定儀Vitek 2 compact購自法國梅里埃公司；Flexcycler型梯度PCR擴增儀購自德國Analytikjena公司；Tanon1600型全自動凝膠成像分析系統購自上海天能科技有限公司；電泳儀購自美國Bio-red公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；PCR實驗過程試劑、電泳用DNA Marker、PCR Master Mix（2×）等相關試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司；美洛培南紙片（10 μg/片）和亞胺培南（30 μg/片）購自英國Oxoid公司。

1.3藥敏實驗 采用法國梅里埃公司GN13鑒定藥敏復合板進行常規藥敏試驗，檢測抗菌藥物包括：頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南，美洛培南用K-B法進行檢測，大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株，操作方法及結果判斷參照CLSI標準。

1.4改良Hodge試驗 先調0.5麥氏單位的大腸埃希菌（ATCC25922）菌液，然后將稀釋10倍的菌液均勻涂布在MH瓊脂平板上，將美洛培南紙片（10 μg/片）貼在中間位置后用接種環挑取新鮮待測菌株從紙片邊緣向外劃直線，要求直線呈放射樣分布。35℃培養18～24 h，美洛培南抑菌圈處出現被檢菌增強（矢狀）生長者為改良Hodge試驗陽性，提示該菌株產碳青霉烯酶。

1.5EDTA協同試驗檢測金屬酶 采用亞胺培南和乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）紙片的雙紙片協同法。按K-B法涂布新鮮待測菌于MH瓊脂平板，在MH瓊脂平板一側貼一張亞胺培南紙片（30 μg/片），并將一張空白紙片貼在亞胺培南紙片另一側，使兩紙片邊緣之間的距離為10～15 mm，然后在空白紙片上滴加0.5 mol/L的EDTA溶液10 μl，置35℃孵育24 h后觀察結果，在含EDTA的空白紙片方向處亞胺培南抑菌圈擴大者，為協同試驗陽性，可判定該菌株產金屬β-內酰胺酶［4］。

1.6耐藥基因檢測 煮沸法提取細菌DNA，PCR方法擴增KPC-2及其他常見的碳青霉烯耐藥基因如NDM-1、SME、OXA-48、GES、VIM、IMP等，PCR擴增引物條件參考文獻［5］，引物序列見表1。PCR反應體系共50 μl，25 μl PCR mix試劑，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，雙蒸水22 μl。反應參數：95℃預變性5 min，95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、50 s，共35個循環，72℃延伸10 min。PCR產物經12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像系統顯像觀察結果。

表1　目的基因引物序列及長度

1.7染色體DNA同源性分析 腸桿菌基因間重復共有序列ERIC-PCR分析耐藥菌株同源性，ERICPCR引物序列［6-7］為ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃、45 s，40℃、1 min，65℃、8 min，30個循環，最后延伸65℃、16 min，產物經12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析。

2　結果

2.1菌株來源及分布 44株菌株主要來自于重癥監護室（ICU）（10例）、呼吸內科（6例）、神經內科（2例）、神經外科（13例）、急診內科（2例）、急診ICU（EICU）（4例）、泌尿外科（1例）、普外科（1例）、血液內科（4例）、肝病科（1例）等，標本類型為痰（31例）、尿液（7例）、全血（3例）、腹水（1例）、腦脊液（1例）及切口分泌物（1例）。

2.2抗菌藥物敏感度試驗結果 44株CRKP經藥敏鑒定后均表現為對碳青霉烯類藥物耐藥，有95%以上的CRKP對頭孢類藥物耐藥，見表2。

表2　CRKP對15種抗菌藥物的耐藥性分析［n=44，n（%）］

2.3改良Hodge試驗與EDTA協同試驗試驗結果44株肺炎克雷伯菌中改良Hodge試驗陽性41株，陽性率93.2%，EDTA協同試驗檢測試驗結果均為陰性。見圖1。

2.4耐藥基因檢測結果 PCR結果顯示KPC-2陽性檢出率最高為42株，見圖2。未檢出NDM-1、SME、IMP、OXA-48、VIM、GES陽性菌株。

2.5同源性分析結果 用ERIC-PCR的方法對44株CRKP DNA擴增，根據瓊脂糖凝膠電泳的條帶的結果進行基因分型，根據細菌同源性標準［8］，44耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌產生的擴增條帶數在3～7，形成指紋圖譜，見圖3。44株肺炎克雷伯菌根據ERIC-PCR產物電泳分為14個亞型：Ⅰ型18株、Ⅱ型5株、Ⅲ型4株、Ⅳ型3株、Ⅴ～Ⅷ型各2株、Ⅺ～XIV型各1株，各型的臨床分布見圖4。

圖1　表型實驗A：Hodge試驗；B：EDTA協同試驗

圖2　部分分離肺炎克雷伯菌株KPC-2基因瓊脂糖凝膠電泳結果M：DL 2000 DNA Marker；P：陽性對照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705；N：陰性對照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706；1～11：KPC-2基因陽性菌株；12：KPC-2基因陰性菌株

圖3　部分耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指紋圖譜M：DL 2000 DNA Marker；1～21：1～21號肺炎克雷伯菌株指紋圖譜

圖4　14型CRKP各科室分布情況

3　討論

肺炎克雷伯菌感染在臨床非常常見，通過翻閱臨床病例資料，顯示在感染肺炎克雷伯菌的患者里，大部分進行過有創性操作包括深靜脈置管、氣管插管、胃腸減壓或者患有腸梗阻、腸穿孔等致腸道菌群明顯異位的疾病，從而反映出肺炎克雷伯菌條件性致病菌的特點—易發生于免疫力低的老年人或嬰幼兒、有基礎疾病（糖尿病或腎病）、住院時間較長、接受有創性醫療操作的患者，特別是ICU的患者更是易感人群。通過每年細菌耐藥網監測，碳青霉烯類藥物在治療肺炎克雷伯菌的同時也造成細菌耐藥率逐年增高，CRKP引起的感染在細菌感染性疾病中所占的比重也日漸增加，其嚴峻形勢已不容樂觀［9］。

本研究中，44株CRKP對頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南的耐藥率都為90%～100%，對阿米卡星的耐藥率為68.2%，對左氧氟沙星、環丙沙星的耐藥率為65.9%和72.7%，對培南類藥物的耐藥率為97%～100%，符合KPC酶能夠水解各種臨床常規使用抗菌藥物的報道［10］，以上數據表明我院分離的CRKP多為高水平耐藥的多重耐藥菌。

44株臨床分離的CRKP，改良Hodge試驗陽性有41株，陽性檢出率為93.1%。而根據碳青霉烯酶基因檢測共檢出42株基因陽性菌株，檢出率為95.5%，以上數據表明KPC-2基因檢測的陽性率比改良Hodge試驗高，因此在碳青霉烯酶的初步篩查中可以做改良Hodge試驗，若要進一步區分確認還需做碳青霉烯酶基因檢測。

碳青霉烯酶的基因位于可轉移的質粒上，依靠多種基因元件進行傳播，獲得性耐藥基因和可移動遺傳元件是引起肺炎克雷伯耐藥的重要機制［11-12］，這也是多重耐藥菌株易于傳播的重要原因［13］。CRKP有多種耐藥機制，包括產碳青霉烯類水解酶，外膜蛋白缺失，產大量ESBL或AmpC酶，細菌細胞壁上PBP改變，產生主動外排泵等，其中產碳青霉烯水解酶占主要因素，特別是KPC-2、NDM型碳青霉烯酶是醫院感染重點關注對象。本研究中表明我院KPC-2型碳青霉烯酶的檢出率為95.5%，說明在產KPC-2肺炎克雷伯菌已在我院成流行趨勢。

結合ERIC-PCR結果，根據臨床流行病學資料分析，本研究中產KPC-2酶的肺炎克雷伯菌主要有兩個克隆群出現院內播散，分別是Ⅰ型和Ⅱ型克隆群。其中Ⅰ型克隆群是最主要的型別，涉及神經外科、ICU、血液內科、神經內科和普外科，從2013年5月～12月均有流行，估計與ICU頻繁出現與其它科室的患者相互轉診治療的情況有關，其可能是導致該菌株在全院范圍播散流行的主要原因［14］。因此，其可能是導致Ⅰ型克隆菌株播散至全院的中間關鍵環節。在Ⅰ型克隆群中可以明顯發現在ICU和神經外科病房的菌株播散現象。神經外科一般以腦外傷患者居多，手術難度大，術后病情需要多方位監護，需在術后進ICU觀察。而其他入住ICU的患者主要為病情嚴重和免疫水平低下者，易反復感染而需要長期使用多種抗菌藥物治療，使ICU病區成為多重耐藥菌容易爆發流行的地方，也是造成克隆株流行的原因［15］。Ⅱ型克隆群涉及ICU、神經外科和神經內科。也可見Ⅱ型克隆群在ICU內有短期傳播流行現象發生。其它各克隆群主要是散發于臨床科室，并未造成播散流行。因此，使用抗菌藥物治療前，要做好藥敏檢測工作，同時將環境的清潔與消毒做到位，已感染患者和未感染患者隔離開等，阻斷該類耐藥菌的傳播。

為了預防院內感染和多重耐藥菌在院內傳播和暴發流行，臨床醫師和檢驗科醫師應協同合作、加強彼此間溝通；微生物室增加藥敏檢測的種類，為臨床醫師提供更多的選擇；協助院感辦對臨床進行監督。為了減少耐藥菌株的出現，檢驗科要提供準確藥敏實驗結果，臨床醫師在此基礎上結合病情合理用藥，尤其是要高效廣譜類的抗菌藥物一定要慎重，以防發生可選用抗菌藥物非常有限甚至無藥可用的情況。

綜上所述，早期預防和治療是阻止院內感染和多重耐藥菌院內傳播的重中之重，只有科學使用抗菌藥物，加強對多重耐藥菌的監測和流行病學研究，并及時采取有效措施才能預防該類細菌導致醫院感染的流行。

［1］ 胡付品，朱德妹，汪復，等.2011年中國CHINET細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2012，12（5）：321-9.

［2］ 胡付品，朱德妹，汪 復，等.2013年中國CHINET細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2014，14（5）：365-74.

［3］ 汪 復，朱德妹，胡付品，等.2012年中國CHINET細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2013，13（5）：321-30.

［4］ Piekarska K，Zacharczuk K，Szych J，et al.Dissemination of the KPC carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae in a hospital in Warsaw，Poland［J］.Med Dosw Mikrobiol，2010，62（1）：9-20.

［5］ Yong D，Park R，Yum J H.Further modification of the Hodge test to screen AmpC beta-lactamase（CMY-1）-producing strainsof Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae［J］.J Microbiol Methods，2002，51（3）：407-10.

［6］ Pereira P S，Dearaujo CFM，Seki L M，et al.Update of the molecular epidemiology of KPC-2-roducing Klebsiella pneumoniae in Brazil：Spread eof clonal complex 11（ST11，ST437 and ST340）［J］.J Antimicrob Chemother，2013，68（2）：312-6.

［7］ 李 麗，劉 嵐.肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶檢測方法的研究進展［J］.中國微生態學雜志，2012，24（4）：375-78，382.

［8］ Duan H，Chai T，Liu J，et al.Source identification of airborne Escherichia coliof swine house surroundings using ERIC-PCR and REPPCR［J］.Environ Res，2009，109（5）：511-7.

［9］ 周 蓉，朱衛民.肺炎克雷伯菌分子流行病學及耐藥機制研究進展［J］.國外醫藥（抗生素分冊），2012，33（1）：1-5，42.

［10］Espedido B A，Steen J A，Ziochos H，et al.Whole genome sequence analysis of the first Australian OXA-48-producing outbreak-associated Klebsiella pneumoniae isolates：the resistome and in vivo evolution［J］.PLoS One，2013，8（3）：59920.

［11］Gulmez D，Woodford N，Palepou M F，et al.Carbapenem-resistant Escherishia coli and Klebsiella pneumoniae isolates from Turkey with OXA-48-like carbapenemases and outer membrane proteinloss［J］.Int J Antimicrob Agents，2008，31（6）：523-6.

［12］費靜嫻，吳蓮鳳，彭定輝，等.銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥性［J］.中國公共衛生，2010，26（10）：1258-60.

［13］Vatopoulos A.High rates of metallo-beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in Greece-a review of the current evidence［J］. Euro Surveill，2008，13（4）.pii：8023.

［14］Yang J，Ye L，Guo L，et al.A nosocomial outbreak of KPC-2-producmg Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital：dissemination of STll and emergenceof ST37，ST392 and ST395［J］.Clin Microbiol Infect，2013，19（11）：E509-15.

［15］王春艷，周樹生，曹曉光，等.普通科室分離菌與ICU分離菌分布及耐藥性的對比性研究［J］.安徽醫科大學學報，2015，50（3）：337-41.

Analysis of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae molecular epidemiology and antibiotic resistance gene

Chu Wenwen，Liu Zhou，Yang Kai，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the molecular epidemiology characteristics and drug resistance genes of imi-penem-resistant Klebsiella pneumoniae isolated.Methods A total of 44 strains of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae were collected and identified.Conventional drug susceptibility test was made by Vitek 2 compact automatic microbe susceptibility analyzer appraisal.Susceptibility testing for antibiotics was performed by the disc diffusion method carbapenemase production was confirmed by modified Hodge test and MBL production by IPM/IPMEDTA combined disc test.The resistant genes were detected by PCR.Molecular epidemiology characteristics were analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence（ERIC）-polymerase chain reaction（PCR）.Results A total of 44 strains of bacteria showed a high level resistance to routine antibiotics including carbapenems，penicillins，cephalosporin and aztreonam.A total of 41 strains were positive in modified Hodge test and all the 44 strains were negative to enzyme detection test.PCR result showed that 42 strains were of KPC-2 type，none of other gene types.ERIC-PCR result showed that 44 strains of Klebsiella pneumoniae were divided into 14 types，and the main type was type I.18 strains belonged to type I from ICU and neurosurgery.Conclusion Klebsiella pneumoniae that resists to carbapenem shows high levels of resistance to routine antibiotic in our hospital.Strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae appear，KPC-2 is the main reason to cause the bacterial resistance to carbapenems. Frequent transfer treatment of the patients among ICU and other clinical departments is the primary factor of carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia epidemic in the entire hospital.

Klebsiella pneumoniae；carbapenemases；ERIC-PCR；KPC-2

R 378.1

A

1000-1492（2016）06-0809-05

2016-04-14接收

國家自然科學基金（編號：81171662）

安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科，合肥 230601

儲雯雯，女，檢驗主管技師，碩士研究生；管世鶴，男，教授，主任技師，博士生導師，責任作者，E-mail：shiheguan@126.com