丙泊酚對原代培養大鼠皮層神經元BDNF和p75NTR水平的影響

李建立，崔紅賞，王　蓓，吳紅海，侯艷寧

丙泊酚對原代培養大鼠皮層神經元BDNF和p75NTR水平的影響

李建立1，崔紅賞2，王蓓3，吳紅海4，侯艷寧4

目的 探討丙泊酚對原代培養大鼠皮層神經元凋亡的影響及可能機制。方法 原代培養7 d的大鼠皮層神經元，隨機分為兩組：溶劑對照組（給予相同容積的20%脂肪乳劑），丙泊酚組（丙泊酚終濃度為500 μmol/L），上述藥物處理皮層神經元12 h后，用光學顯微鏡觀察兩組皮層神經元的形態學變化，MTT法檢測神經元存活率的變化，Western blot法檢測神經元腦源性神經營養因子（BDNF）、p75神經營養因子受體（p75NTR）以及B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）蛋白水平的變化。結果 與溶劑對照組比較，丙泊酚組光鏡下觀察顯示皮層神經元數量明顯減少，胞體立體感消失，細胞輪廓不清，神經元軸突斷裂。神經元存活率顯著性下降（P＜0.01），BDNF和Bcl-2蛋白水平顯著性下降（P＜0.01），p75NTR蛋白水平顯著性增加（P＜0.01）。結論 丙泊酚可引起發育期原代培養皮層神經元損傷，其機制可能與下調BDNF、Bcl-2和上調p75NTR蛋白水平有關。

原代培養皮層神經元；丙泊酚；神經凋亡；BDNF；p75NTR；Bcl-2

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.026.html

全世界每年有眾多患兒由于各種原因需要接受全身麻醉。丙泊酚通過激動γ氨基丁酸A型受體和抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體發揮麻醉作用。丙泊酚因具有起效快、消除快、不良反應少等優點，被廣泛用于麻醉誘導和維持。雖然藥典顯示丙泊酚慎用于3歲以下患兒，但在實際臨床工作中，丙泊酚被廣泛應用于嬰幼兒麻醉。目前有關丙泊酚是否具有發育期神經毒性、對發育期大腦產生神經損傷觀點不一。最近體外細胞研究［1-3］表明丙泊酚可誘導原代培養神經元產生凋亡樣損傷，但其機制尚未完全明確。作為神經營養因子家族的一員，腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的含量最為豐富，廣泛分布于中樞神經系統，BDNF對神經元的發育、存活、分化等發揮著重要的作用，具有保護神經元免受外界環境刺激的損傷以及促進受損神經元再生的功能［4］。該研究擬通過觀察丙泊酚對發育期原代培養皮層神經元以及對BDNF、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和p75神經營養因子受體（p75 neurotrophic receptor，p75NTR）蛋白水平的影響，探討丙泊酚發育期神經毒性的發生機制。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑 丙泊酚（diprivan，批號：KW814）購自意大利AstraZeneca公司；20%脂肪乳購自廣州百特公司；DMEM培養液、胎牛血清、Neurobasal培養液、B27促生長劑購自美國Gibco公司；DMSO、MTT購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自北京索來寶公司；微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）、BDNF、Bcl-2和p75NTR購自美國Santa Cruz公司。

1.2皮層神經元原代培養 取新生的SD幼鼠（24 h內）大腦雙側額葉皮質，在冷PBS液中洗劑，剪碎，置入0.125%胰蛋白酶中，放入37℃水浴鍋內充分消化15 min，然后用含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，吸棄上清液，然后把細胞轉移到含10%胎牛血清的DMEM培養基中，用巴氏滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。然后經100目鋼絲篩過濾，計數后按1×109/L的密度接種于經多聚賴氨酸處理的培養板中，置于5%CO2培養箱37℃恒溫培養24 h后，全量換Neurobasal+B27培養基培養，以后每隔2 d半量換液1次。體外培養7 d的神經元用于實驗。

1.3實驗分組 隨機分為溶劑對照組（給予相同容積的20%脂肪乳劑），丙泊酚組（丙泊酚終濃度為500 μmol/L）。

1.4免疫組化鑒定皮層神經元 體外培養7 d的皮層神經元用多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，每次5 min，然后用10%山羊血清封閉30 min，PBS洗3遍，每次5 min，加入鼠抗MAP-2（1∶200），4℃過夜。PBS洗3遍，每次5 min，然后加入熒光二抗（1∶100），37℃孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察，計數。

1.5光鏡顯微鏡下觀察不同藥物處理后皮層神經元的形態變化 將細胞接種于6孔板，體外培養至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，在光鏡顯微鏡下觀察不同藥物處理后皮層神經元的形態變化。

1.6MTT法檢測神經元存活率 將細胞接種于96孔板，體外培養至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，移去培養液，每孔加入10 μl MTT液，37℃孵育4 h，加入200 μl DMSO輕輕振蕩溶解甲臜結晶，在多功能酶標儀上測定570 nm的吸光度（optical density，OD）值。以對照組平均OD值為100%，細胞存活率（%）=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.7Western blot法測定BDNF、Bcl-2和p75NTR蛋白含量 神經元經各種處理后，收集神經元，細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白含量。取待測蛋白質50 μg加上樣緩沖液煮沸變性，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中100 V電泳1.5 h，轉膜2 h，加入BDNF、Bcl-2和p75NTR抗體（1∶1 000），4℃過夜，常規洗滌，加羊抗鼠二抗（1∶5 000），37℃孵育60 min，洗滌，電化學法發光，顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶與內參照條帶OD比值。實驗重復3次，設β-actin蛋白為內參。

1.8統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析。計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2　結果

2.1原代培養皮層神經元鑒定 MAP-2行原代培養大鼠皮層神經元鑒定，神經元純度＞90%。

2.2丙泊酚對原代培養皮層神經元形態的影響原代培養7 d的大鼠皮層神經元經丙泊酚處理12 h后在光學顯微鏡下觀察，顯示溶劑對照組神經元生長良好，神經元胞體豐滿，突起較長，相互之間形成復雜的神經網絡。丙泊酚組神經元生長狀態差，神經元胞體立體感消失，顏色變暗，細胞輪廓不清，神經元軸突斷裂，部分神經元出現死亡。見圖1。

2.3丙泊酚對皮層神經元存活率的影響 與對照組（99.8±4.1）%比較，丙泊酚組神經元存活率（54.4±6.4）%顯著性下降（t=8.457，P＜0.01）。見圖2。

圖1　不同處理對皮層神經元形態的影響 ×200A：溶劑對照組；B：丙泊酚組

圖2　丙泊酚對神經元存活率的影響（n=6，±s）與對照組比較：**P＜0.01

2.4丙泊酚對皮層神經元BDNF蛋白水平的影響與對照組比較，丙泊酚組皮層神經元BDNF蛋白水平顯著性下降（t=7.892，P＜0.01）。見圖3。

圖3　丙泊酚對神經元BDNF表達的影響（n=3，±s）與對照組比較：**P＜0.01

2.5 丙泊酚對皮層神經元Bcl-2蛋白水平的影響與對照組比較，丙泊酚組皮層神經元Bcl-2蛋白水平顯著性下降（t=4.215，P＜0.01）。見圖4。

圖4　丙泊酚對神經元Bcl-2表達的影響（n=3，±s）與對照組比較：**P＜0.01

2.6丙泊酚對皮層神經元p75NTR蛋白水平的影響 與對照組比較，丙泊酚組皮層神經元p75NTR蛋白水平顯著性增加（t=8.432，P＜0.01）。見圖5。

圖5　丙泊酚對神經元p75NTR表達的影響（n=3，±s）與對照組比較：**P＜0.01

3　討論

麻醉藥是否影響發育期神經元，影響突觸的形成，是目前臨床和基礎研究的一個重要課題。近年來一些研究［5］表明全麻藥具有發育期神經毒性，可誘導發育期大腦神經損傷。丙泊酚作為臨床上常用的一種全身麻醉藥，具有起效快、消除迅速和不良反應少的優點，成為小兒麻醉時常用的麻醉藥之一。丙泊酚是否適合應用于新生兒和嬰幼兒的全身麻醉，目前仍存在爭議。最近動物實驗研究［6-8］表明丙泊酚可對發育期動物大腦廣泛腦區產生凋亡樣損傷，并引起動物成年后的學習記憶功能障礙。為進一步了解丙泊酚是否可對發育期大腦產生神經損傷，該研究擬觀察丙泊酚對原代培養皮層神經元的損傷作用以及與BDNF、Bcl-2和p75NTR蛋白變化的關系，結果顯示丙泊酚通過降低BDNF、Bcl-2和增加p75NTR蛋白水平引起神經元形態學損傷，同時引起神經元存活率接近50%的下降。

關于丙泊酚引起發育期神經元損傷的機制目前仍不清楚。神經營養因子包括神經生長因子、BDNF、神經生長因子-3和堿性成纖維細胞生長因子等。BDNF作為在神經系統主要表達的神經營養因子，廣泛存在于大腦皮層和海馬組織，對神經元的增殖和存活發揮著重要的作用［9］。BDNF與TrkB結合后啟動細胞內信號轉導途徑包括激活轉錄因子CREB，上調Bcl-2的表達，保護神經元免受外界刺激的損傷，發揮神經保護作用［10］。Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，存在于線粒體和內質網等結構，促進細胞存活、抑制細胞凋亡，其水平降低可能誘導細胞凋亡［11］。以往研究［1，12］表明丙泊酚引起發育期大鼠大腦神經損傷與BDNF和Bcl-2蛋白水平的下降有關。本實驗結果顯示與溶劑對照組比較，500 μmol/ L丙泊酚作用神經元12 h引起神經元BDNF和Bcl-2蛋白水平的顯著性下降，說明丙泊酚誘導皮層神經元損傷可能與神經元BDNF和Bcl-2蛋白水平的下降有關。神經營養因子低親和力受體p75NTR屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是已知最早分離出來的神經營養因子受體，在發育過程中呈高表達，隨著發育過程的結束其表達量逐漸降低。p75NTR在神經系統中廣泛分布，以往認為p75NTR與神經營養因子作用一致，二者結合后會促進神經元的存活與分化。然而近年來顯示在一些中樞神經疾病的發病過程中p75NTR的表達增加，敲除或阻斷p75NTR信號可促進神經元存活，延緩疾病的發生［13］，p75NTR表達增加可促進神經元凋亡。研究［14-15］表明全身麻醉藥異氟醚以及咪達唑侖，異氟醚和笑氣聯合應用誘導的發育期大鼠大腦廣泛腦區凋亡樣損傷可能與p75NTR蛋白水平的增加有關。本實驗結果顯示與溶劑對照組比較，500 μmol/L丙泊酚作用神經元12 h引起神經元p75NTR蛋白水平的明顯增加，說明丙泊酚誘導皮層神經元損傷也可能與神經元p75NTR蛋白水平增加有關。

綜上所述，丙泊酚可誘導原代培養皮層神經元損傷，其機制可能與BDNF和Bcl-2蛋白水平的下降和p75NTR蛋白水平增加有關。

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Effects of propofol treatment on BDNF and
p75NTR expression in primary cultured cortical neurons

Li Jianli1，Cui Hongshang2，Wang bei3，et al
（1Dept of Anesthesiology，2Dept of Thoracic Surgery，3Dept of Gynecology，Hebei General Hospital，Shi Jiazhuang 050051）

Objective To investigate the effect of propofol exposure on neuroapoptosis in primary cultured cortical neurons and the mechanisms.Methods Cortical neurons were primarily cultured for seven days，then divided into two groups：vehicle-control group（treated with equal valume of 20%intralipid），propofol-treated group（treated with 500 μmol/L propofol）.The neurons were treated for 12 h.The structure of neurons was analyzed using microscope，the neuron viability was determined by MTT，and Western blot was performed to detect the levels of BDNF，p75NTR and Bcl-2.Results Lack of three-dimensional sense，faded color，unclear outline were observed，and fractured neuron axons or neurons death were observed in neurons treated by 500 μmol/L propofol.Compared with vehicle-control group，the neuron viability decreased greatly（P＜0.01），BDNF and Bcl-2 levels decreased greatly（P＜0.01）and p75NTR level increased greatly in propofol treatment group（P＜0.01）.Conclusion Propofol induces neuroapotosis in primary cultured cortical neurons，which is associated with the decreased levels of BDNF and Bcl-2 and the increased level of p75NTR.

primary cultured cortical neurons；propofol；neuroapoptosis；BDNF；p75NTR；Bcl-2

R 971.2；R 965

A

1000-1492（2016）06-0818-04

2016-01-18接收

河北省衛生廳指令課題（編號：ZL20140095）

河北省人民醫院1麻醉科、2胸外科、3婦產科，石家莊0500514白求恩國際和平醫院藥劑科，石家莊 050082

李建立，男，副教授，醫學博士；侯艷寧，女，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：biph2011 @163.com