慢病毒介導的FoxA1高表達對乳腺癌MCF-7細胞株增殖凋亡探究

鄭　璐，湯　銅，錢　波，周連幫，萬圣云，張　磊，史加寧，李　佳

慢病毒介導的FoxA1高表達對乳腺癌MCF-7細胞株增殖凋亡探究

鄭璐，湯銅，錢波，周連幫，萬圣云，張磊，史加寧，李佳

目的 利用慢病毒載體，構建乳腺癌MCF-7高表達FoxA1細胞株，并初步探究FoxA1對乳腺癌MCF-7細胞株增殖凋亡的影響。方法 將FoxA1基因重組構建慢病毒載體穿梭質粒EX-Z1010-LV201，經PCR和測序后在脂質體Lipofectamine2000介導下轉染293T細胞包裝慢病毒，嘌呤霉素篩選出穩定轉染的細胞，Real-Time PCR法檢測穩定轉染MCF-7細胞株中FoxA1基因的表達水平，MTT及流式細胞術對比高表達FoxA1細胞株與對照細胞株增殖凋亡差異。結果 PCR擴增和測序結果證實成功構建FoxA1慢病毒載體并包裝慢病毒，成功篩選出FoxA1高表達的乳腺癌MCF-7細胞系。MTT及流式細胞術結果顯示：與對照組比較，上調FoxA1乳腺癌MCF-7細胞株增殖下降，凋亡率增加。結論成功構建了重組慢病毒載體，并篩選出穩定高表達FoxA1的MCF-7細胞株，FoxA1可能參與了乳腺癌MCF-7細胞株增殖凋亡調控，為下一步進行其機制探討提供了依據。

FoxA1；慢病毒載體；MCF-7；增殖凋亡

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.028.html

根據美國癌癥協會（ACS）估計，美國2014年確診的乳腺浸潤性癌約235 030例，新確診的乳腺癌病例約62 980例，死于的患者約40 430例［1］，另外約64 640例婦女在同年被診斷患有乳腺原位癌［2］，乳腺癌已成為美國婦女最常見的惡性腫瘤，在過去的幾十年乳腺癌的發病率逐年上升，而死亡率呈現下降趨勢，這得益于對乳腺癌早期發現和更加有效的治療。FoxA1（Forkhead box A1）屬于Fox轉錄因子家族成員之一［3］，又名肝核因子3（HNF-3α），因其是從肝臟中純化而命名。已有報道［4-6］顯示FoxA1在人體許多組織中如乳腺、前列腺、甲狀腺、膀胱、食管、胰腺和肝等部位的組織普遍表達，在雌激素受體陽性的luminal型乳腺癌中FoxA1尤其有很高的表達，并且具有較好的分化和藥物敏感性，有望成為分子分型及預后判斷的一個標志物，提示了其在乳腺癌中的潛在的研究價值。慢病毒（Lentivirus）屬于逆轉錄病毒科（Rerrovidae），這類病毒因含有逆轉錄酶，故稱為逆轉錄病毒［7］。而慢病毒載體（Lentivirus vectors）與其他逆轉錄病毒載體相比，具有可攜帶目的基因片段大、目的基因表達時間長、可侵染分裂細胞及非分裂細胞、不易誘發宿主免疫排斥反應等優點。該研究擬用慢病毒載體介導，構建穩定過表達FoxA1的MCF-7乳腺癌細胞株，為研究該基因對ER（+）的乳腺癌細胞株作用奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑 生物安全柜（北京AIRTECH公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；CO2培養箱（德國Thermo公司）；質粒抽提試劑盒、Rotorgene Real-Time PCR儀（美國Qiagen公司）；GIS-2009凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；乳腺癌MCF-7細胞株由中國科學技術大生命科學院朱濤教授惠贈；DMEM培養基+10%FBS、Trypsin-EDTA Solution（0.05%Trypsin-EDTA）（南京Corning公司）；胎牛血清、胰酶和DMEM培養基（德國Gibco公司）；嘌呤霉素（日本Sigma公司）；6孔板（美國BD公司）；293T細胞、Lipofectamine2000、RNAzol RT RNAIsolationReagent：GeneCopoeia（Cat.No. E01010A）；First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia（Cat.No.C0210A）；All-in-OneTMQ-PCR Mix：GeneCopoeia（Cat.No.AOPR-0200）Primer synthesis（美國Invitrogen公司）；M-MLV逆轉錄酶和dNTP（美國PROMEGA公司）；OligodT（上海生工公司）；Marker（加拿大Fermentas公司）；Age I酶（美國NEB公司）；慢病毒表達載體穿梭質粒EX-Z1010-LV201、Lentivirus-病毒液：LP-Z1010-Lv202-C0010、LP-NEG-Lv202-0200（廣州復能公司）；Annexin VFITC Apoptosis Detection Kit凋亡檢測試劑盒（美國Beckman公司）。

1.2細胞培養 乳腺癌MCF-7細胞株培養于DMEM培養液（另含有10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素），于37℃、5%CO2培養箱培養。

1.3FoxA1表達載體的構建

1.3.1引物設計及合成 上游引物：5′-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3′，下游引物：5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′。

1.3.2重組慢病毒載體質粒的構建 將含目的基因的表達質粒，利用PCR技術擴增，用NotⅠ酶切載體EX-Z1010-LV201，瓊脂糖凝膠電泳進行分離純化。然后將Afl II質粒載體酶切產物與rFoxA1的酶切產物分別瓊脂糖凝膠電泳，回收試劑盒將電泳產物純化。將上一步純化后的2個產物4℃過夜進行連接，轉化感受態細胞，采用PCR鑒定細菌陽性克隆，質粒測序送往廣州復能公司。

1.4慢病毒包裝及滴度測定 將12 μg EX-Z1010-LV201質粒與相應體積的Opti-MEM充分混合，再與相應體積的DNA-Lipofectamine 2000混合均勻，室溫下溫育20 min，將混合液均勻滴至含有293T細胞的培養皿中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。培養約6～8 h后棄去混合液，加入含血清的完全培養基，于37℃、5%CO2培養箱內繼續培養36～48 h。吸取上清液，4 000 r/min、4℃離心10 min，以0.45 μm濾器過上清液于40 ml超速離心管中。再次25 000 r/min、4℃離心20 min，冰PBS重懸病毒沉淀，4℃溶解后過夜。以15 μl每管分裝病毒液，置于-80℃冰箱中長期保存。慢病毒液依次按10倍梯度稀釋為6個濃度后，分別感染293T細胞，細胞培養于DMEM培養液，約3周左右棄去培養液，PBS反復漂洗后，結晶紫染色，倒置顯微鏡觀察細胞克隆數目。

1.5病毒感染及穩轉株的篩選 將MCF-7細胞計數后鋪到6孔板中培養，各孔加入2 ml DMEM培養基（添加10%FBS、青霉素-鏈霉素雙抗溶液），在5%CO2條件下，37℃培養24 h。鋪板24 h后每孔加入LP-Z1010-Lv202-C0010 50 μl慢病毒，LP-NEGLv202-0200加入20 μl慢病毒到MCF-7細胞中，混勻后于37℃、5%CO2培養48 h。感染48 h后，觀察慢病毒侵染結果，拍攝細胞熒光圖片。用胰酶消化感染過的細胞并轉移至6孔板（每塊6孔板對應一種慢病毒，留出1孔用于陰性對照細胞），以含2 μg/ml嘌呤霉素的DMEM培養基（添加10%FBS、青霉素-鏈霉素雙抗溶液）進行藥篩培養。連續加藥培養12 d（嘌呤霉素濃度2 μg/ml），待細胞長滿后，收取樣品進行后續檢測。

1.6FoxA1高表達檢測

1.6.1RNA抽提 先離心收集細胞，約（5～10）× 106細胞數加1 ml TRIzol反復吹打裂解細胞。每1 ml TRIzol中加入200 μl氯仿，蓋上蓋子，振蕩混勻約15 s，室溫靜置2～5 min，然后12 000 r/min、4℃離心約15 min，輕柔取出離心管，小心吸取最上層上清液約450 μl（每1 ml TRIzol的吸取量）至事先預備好的一支含有600 μl冷凍異丙醇的新離心管中，上下顛倒混勻，-20℃靜置至少30 min，12 000 r/ min、4℃離心10 min。棄上清液，加入500 μl冷凍的75%乙醇溶液，混勻后12 000 r/min、4℃離心5 min，棄去上清液，再次離心，吸棄上清液。將沉淀自然風干，加入約30～50 μl DEPC水溶解沉淀，貼上標簽-80℃保存備用。

1.6.2反轉錄反應 解凍First Strand cDNA Synthesis Kit的試劑，混勻，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應條件如下：42℃、30 min，95℃變性5 min，4℃退火5 min。

1.6.3Real-Time PCR實驗 兩細胞株cDNA產物進行Real-Time PCR實驗，反應條件如下：首先95℃、5 min，然后95℃變性30 s，60℃退火15 s，共循環40次，最后繪制熔解曲線，按照SYBR Green染料Rotor-gene 3000設置。實驗結果按照2-ΔΔCt方法計算：目的基因拷貝數2-ΔΔCt=2-（ΔCt目的基因-ΔCt內參基因），每個基因同時設復孔3個，重復3次。

1.7MTT法檢測FoxA1上調后MCF-7增殖水平改變 取對數生長期含目的基因穩轉株LP-Z1010-Lv202-C0010和對照病毒穩轉株LP-NEG-Lv202-0200，按5 000個/孔接種于96孔板，共接種5板，每組9孔，另取1孔為對照，于37℃、5%CO2培養箱中培養，分別取24、48、72、96、120 h各時間點1板，每孔各加入20 μl（5 mg/ml）MTT，繼續培養4 h，終止培養，去除孔內上清液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光密度（optical density，OD）值，重復3次，取平均值。

1.8流式細胞術檢測FoxA1上調后MCF-7凋亡水平改變 按50 000個/孔接種于6孔板，培養72 h后，按AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit凋亡檢測試劑盒步驟檢測兩組細胞株凋亡差異，分別記錄含目的基因穩轉株LP-Z1010-Lv202-C0010和對照病毒穩轉株（LP-NEG-Lv202-0200），早期凋亡（An+ PI-）及晚期凋亡（An+PI+）細胞總百分率，重復3次，取平均值。

1.9 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，數據以±s表示，若服從正態分布資料，兩組均數間的比較采用兩組獨立樣本t檢驗，若為偏態分布資料，兩組均數間的比較采用兩獨立樣本非參數檢驗。

2　結果

2.1FoxA1質粒構建 rFoxA1擴增的條帶處于1 000 bp與2 000 bp之間，大約為1 400 bp，與目的條帶相符，見圖1。

圖1　目的基因rFoxA1 PCR擴增產物電泳M：Marker；1、2、3：rFoxA1的目的基因片段

2.1FoxA1過表達慢病毒構建 將FoxA1基因重組構建慢病毒載體穿梭質粒EX-Z1010-LV201，載體結構圖及酶切質粒結果見圖2、3。

2.2MCF-7細胞FoxA1高表達體系建立

2.2.1熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒轉染 轉染細胞株于熒光倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態及轉染效率，見細胞生長狀態良好，轉染后細胞熒光強度高，見圖4。

2.2.2Real-Time PCR法檢測對照及穩轉株表達采用Real-Time PCR法檢測對照及穩轉株內參基因GAPDH及基因FoxA1 mRNA水平表達情況，分別繪制擴增曲線及熔解曲線，見圖5。

2.2.3FoxA1表達量分析結果 針對載體pEZLv202設計特異性引物進行反轉錄，目的穩轉株LPZ1010-Lv202中FoxA1的表達量為對照穩轉株LPNEG-Lv202的46.19倍，見表1。

圖2　慢病毒EX-Z1010-Lv202載體

表1　Real-Time PCR法檢測對照及穩轉株表達結果

2.3FoxA1表達量上調后MCF-7增殖水平改變MTT結果顯示，第2天（t=20.280，P＜0.01）、第3天（t=9.473，P＜0.01）、第4天（t=12.742，P＜0.01）、第5天（t=8.892，P＜0.01）FoxA1過表達細胞株增殖水平均較對照細胞株下降，可見FoxA1高表達可下調MCF-7細胞株增殖水平（t=4.472，P＜0.01），見圖6。

2.4FoxA1表達量上調后MCF-7凋亡水平改變

圖3　酶切鑒定的電泳結果Lane M：100（A）、6 000（B）、15 000（C）bp DNA Ladder；1：慢病毒EX-Z1010-lv202；2：慢病毒EX-Z1010-lv202NotI酶切結果，共有3條預期酶切條帶（7 872、1 036、1 171 bp）；3：EX-Z1010-lv202 Afl II酶切結果，共有2條預期酶切條帶（2 960、7 119 bp）

圖4　穩轉株細胞及熒光照片 ×100A：細胞照片；B：含目的基因穩轉株（LP-Z1010-Lv202-C0010）熒光照片；C：細胞照片；D：對照病毒穩轉株（LP-NEG-Lv202-0200）熒光照片

圖5　Real-Time PCR法檢測內參基因GAPDH及目的基因FoxA1A：GAPDH基因擴增曲線；B：GAPDH基因擴增后熔解曲線；C：FoxA1基因擴增曲線；D：FoxA1基因擴增后熔解曲線

圖6　MTT法比較兩細胞株增殖差異（n=3，±s）與LP-Z1010-Lv202-C0010比較：**P＜0.01

根據流式細胞術檢測LP-Z1010-Lv202-C0010及LP-NEG-Lv202-0200凋亡率分別為（5.10± 0.37）%，（3.50±0.26）%，較對照細胞株，FoxA1高表達可上調MCF-7細胞株凋亡率（Z=-2.309，P= 0.021），見圖7。

圖7　流式細胞術檢測兩細胞株凋亡（n=3，±s）A：LP-Z1010-Lv202-C0010；B：LP-NEG-Lv202-0200

3　討論

Fox家族基因又稱叉頭基因自1989年最早在果蠅中被發現，各種不同的種屬逐漸被人們認識，目前根據其結合區域的相似性，在不同種屬中已發現100多個Fox家族成員，包括FoxA-FoxS，分屬于17個不同亞族。其家族的特征性結構稱為叉頭盒（Fork-head box），其特征結構的DNA結合區域為具有進化保守性的110個氨基酸組成。該特征結構位于蛋白質的核心區域，由3個α螺旋和2個翼狀的環形結構組成，外觀形似蝴蝶，故又稱為帶翼的螺旋區域（DBD）。FoxA家族包括FoxA1-Fox3 3個亞群，因其最早從小鼠肝細胞中被發現，故又名肝核心因子（HNF）。以FoxA1為代表，在人類染色體上，FoxA1定位于14q21.1，其核心區域位于N-端，又稱叉頭區域或翼狀螺旋域（WHD）結構（H1-S1-H2-H3-S2-L1-S3-L2），包括3個β-折疊S，α-螺旋H和2個循環形成的螺旋般的翅膀［8］。

FoxA與DNA的結合區域類似于組蛋白H結構，C-端能夠與組蛋白H3、H4作用，FoxA通過與染色質相關作用，可以替代組蛋白H1功能，使染色質結構松散，同時還參與了組蛋白H3第4個賴氨酸的單二甲基化和DNA去甲基化過程［9］。這些特征結構使FoxA能夠與染色質緊密結合，并且即使在缺乏其他染色質修飾酶情況下，也能夠松解核小體。FoxA還可以提高染色質對其它轉錄因子的募集能力，同時通過招募其它轉錄因子并聯合ATP酶，進一步使染色質結構松解，因此，FoxA被譽為“先鋒因子”［10］。

國內對FoxA1研究的文獻較少，研究［11-12］報道：轉錄因子FoxA1在人體多種組織中，如：甲狀腺、肺、白血病、乳腺、肝、膀胱、胰和前列腺等中均可檢測到其表達，并可以和大約一百多個啟動子結合，共同調節細胞信號及細胞周期。研究［13］顯示FoxA1在肺癌、白血病、分化型甲狀腺癌、乳腺癌、胰腺癌和轉移性前列腺癌組織中高表達。研究［14］證實乳腺癌細胞中，FoxA1可以與多個雌激素受體結合位點相關作用，其與雌激素受體共同對下游靶基因的轉錄進行調控。乳腺癌細胞株普遍高表達FoxA1，ER陽性乳腺癌患者高表達FoxA1，往往預示較好的預后。最新的報道［15］顯示，FoxA1同樣能夠與甲基化相關的增強子結合，解開其致密結構，促進多種基因的表達上調。FoxA1是否參與調控全基因組甲基化信號傳導通路，能否通過改變FoxA1表達來調控腫瘤相關基因的甲基化狀態，進而干擾相關癌基因及抑癌基因的表達是本課題組研究的方向。

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Overexpression of FoxA1 by an adenoviral vector and its effects on cell cycle and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells

Zheng Lu，Tang Tong，Qian Bo，et al
（Dept of General Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the effects of FoxA1 overexpression on proliferation and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7 by constructing high-level expression vetor FoxA1 for MCF-7 cell line.Methods FoxA1 gene was amplified by PCR to construct the recombinant shuttle plasmid EX-Z1010-LV201.After DNA sequence analysis，the recombinant lentiviral package plasmid was transfected into 293T cells by Lipofectamine 2000 to construct packed lentivirus.Stable transfected cell lines were selected out by puromycin.The FoxA1 protein expression level of stable MCF-7 cell line was detected by real-time PCR method.Differences of cell proliferation and cell apoptosis between FoxA1 overexpressed cell line and empty vector cell lines were determined by MTT assay and FCM.Results The recombinant FoxA1 lentiviral vectors and packed lentivirus were confirmed by PCR and DNA sequencing，and MCF-7 cell lines transfected by packed lentivirus which stably overexpress FoxA1 were successfully selected.MTT and FCM results presented a significant decrease of cell proliferation in human breast cancer MCF-7 cell lines with up-regulated FoxA1.Conversely，more obvious apoptosis was presented in MCF-7 cell lines with up-regulated FoxA1 than the control group.Conclusion FoxA1 is successfully selected and MCF-7 cell lines are transfected by packed lentivirus which are stably overexpressed.FoxA1 is involved in some important intracellular process of breast cancer cell line MCF-7，such as cell proliferation and apoptosis.This research provides a valid evidence for further investigation on its mechanism.

FoxA1；lentiviral vector；MCF-7 cell line；cell proliferation and apoptosis

R 346

A

1000-1492（2016）06-0822-06

2016-03-04接收

安徽省自然科學基金（編號：1308085QH152）

安徽醫科大學第二附屬醫院普外科，合肥 230601

鄭 璐，女，碩士，醫師；湯 銅，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：tt20164@126.com