YAP1和β-catenin在大腸癌中的表達及相關性研究

陳順華，尹　玉，曹立宇，張　聰，李玉潔

YAP1和β-catenin在大腸癌中的表達及相關性研究

陳順華1，2，尹玉1，2，曹立宇1，2，張聰1，2，李玉潔1，2

目的 探討Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）和β-連環蛋白（β-catenin）在大腸癌組織中的表達及其與腸癌患者臨床病理因素間的關系。方法 應用免疫組織化學Envision二步法檢測YAP1和β-catenin在99例人大腸癌組織及30例正常腸黏膜組織中的表達狀況。結果

YAP1蛋白在大腸癌組織中的陽性表達率為56.57%（56/ 99），顯著高于正常腸黏膜組織16.67%（5/30）（Χ2= 14.704，P＜0.01）；β-catenin蛋白在大腸癌組織中的異位（細胞質/核）表達率為51.52%（51/99），明顯高于正常腸黏膜組織0%（0/30）（Χ2=25.559，P＜0.01）。YAP1蛋白的表達與患者性別、年齡、腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及臨床Duke′s分期均無關；β-catenin蛋白的細胞核表達與大腸癌的分化程度及浸潤深度相關（Χ2=6.641、4.229，P＜0.05）；β-catenin蛋白的細胞質表達水平與大腸癌的分化程度相關（Χ2=6.761，P＜0.05）；β-catenin蛋白的細胞膜表達水平與臨床病理因素均無關。β-catenin蛋白細胞質、細胞核的表達與YAP1細胞核、細胞質/核的表達呈正相關性（P＜0.05）；β-catenin蛋白細胞核表達與YAP1細胞質的表達呈正相關性（P＜0.05）。結論 YAP1和β-catenin在大腸癌的發生發展中均具有重要作用，β-catenin細胞的核表達可能有助于大腸癌的預后判斷。

大腸癌；YAP1；β-catenin；免疫組織化學

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.034.html

大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展與個體因素及環境因素有關，在這一過程中有一系列與信號傳導通路有關的基因參與［1］。Wnt信號傳導通路控制細胞的增殖、分化和形態形成，β-連環蛋白（β-catenin）作為Wnt信號通路的重要成員，介導Wnt信號通路的異常激活，與大腸癌的發生關系密切［2］。Hippo信號通路最初在果蠅體內發現，是調節細胞增殖與凋亡的重要的信號傳導通路。Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）是YAP1基因的編碼產物，因此YAP也被稱為YAP1。YAP1（Yes-associated protein 1）是Hippo通路的下游信號分子，具有促進細胞增殖、抑制凋亡的作用。Hippo通路中的其它因子可通過磷酸化負性調控YAP，而該通路的異常調節可促進YAP的過表達，見于多個人類腫瘤包括結腸癌［3-4］。國外最新研究［5］提示YAP過表達可協同β-catenin促進腸道干細胞及腫瘤細胞的增殖。該實驗采用免疫組織化學法檢測YAP1和β-catenin在大腸癌中的表達，探討Hippo及Wnt信號通路在大腸癌發生發展中的作用、相互關系及臨床意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本 收集安徽醫科大學第一附屬醫院病理科2010年7月～2013年12月間大腸癌手術切除標本99例，所有病例術前未接受放療、化療及其它針對腫瘤的特殊治療，術后均經病理證實。另取30例距大腸癌灶邊緣5 cm以上的正常大腸黏膜組織作為對照。所有標本經10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，常規4 μm連續切片，分別作HE染色和免疫組織化學染色。

1.1.2主要試劑 兔抗人YAP1多克隆抗體和兔抗人β-catenin多克隆抗體均購自英國Abcam公司；免疫組織化學Envision二步法染色試劑盒及檸檬酸修復液（pH 6.0）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2實驗方法 免疫組織化學染色（Envision二步法）參照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3結果判定 YAP1免疫組化染色表達主要定位于細胞質及細胞核內，β-catenin可定位于細胞膜、細胞質及細胞核內，陽性細胞呈黃/棕黃色顆粒。采用半定量方法［6］判斷結果：①按細胞染色強弱評分：0分，不著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色；②選取5個高倍視野（×400），計數陽性染色細胞占細胞總數的百分比：0分，＜10%；1分，10%～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，＞75%。按①、②乘積判斷結果：0～4為陰性，5～12為陽性。

1.4統計學處理 應用SPSS 21.0軟件進行分析。計數資料采用采用Χ2檢驗方法及Fisher精確概率法比較各組間的差異，相關性分析采用Pearson檢驗。

2　結果

2.1YAP1和β-catenin蛋白在大腸癌組織和正常大腸黏膜組織中的表達 在大腸癌組織中，YAP1可定位于細胞質及細胞核，其陽性表達率為56.57%（56/99），其中細胞質、細胞核及細胞質/核同時表達的陽性表達率分別為56.57%（56/99）、44.44%（44/99）、44.44%（44/99）；在大腸癌組織中，β-catenin可定位于細胞膜、細胞質及細胞核，其異位（細胞質/核）表達率為51.52%（51/99），其中細胞膜、細胞質、細胞核及核質同時表達的陽性表達率分別為52.53%（52/99）、32.32%（32/99）、37.37%（37/99）、18.18%（18/99）。YAP1和βcatenin蛋白在30例正常大腸黏膜組織中的表達率分別為16.67%（5/30）、0%（0/30）。YAP1蛋白在大腸癌組織中的表達顯著高于正常大腸黏膜組織（Χ2=14.704，P＜0.01），β-catenin蛋白在大腸癌組織中的異位表達顯著高于正常大腸黏膜組織（Χ2= 25.559，P＜0.01）。見圖1～2。

2.2大腸癌中YAP1和β-catenin蛋白表達與臨床病理因素之間的關系 YAP1蛋白表達水平與臨床病理因素均無關（表1）。β-catenin蛋白的細胞核表達水平與大腸癌的分化程度及浸潤深度相關（Χ2= 6.641、4.229，P＜0.05），與患者性別、年齡、淋巴結轉移及臨床Duke′s分期均無關；β-catenin蛋白的細胞質表達水平與大腸癌的分化程度相關（Χ2= 6.761，P＜0.05），與其它臨床病理因素無關；βcatenin蛋白的細胞膜表達水平與臨床病理因素均無關，見表2。

2.3YAP1和β-catenin蛋白在大腸癌組織中表達之間的關系 YAP1和β-catenin蛋白在大腸癌組織中的表達經Pearson等級相關分析處理后顯示：βcatenin細胞質的表達與YAP1細胞核及YAP1細胞質/核的表達呈正相關性（r=0.208，P=0.039；r= 0.208，P=0.039）；β-catenin細胞質的表達與YAP1細胞質的表達無相關性（r=0.126，P=0.213）。βcatenin細胞核的表達與YAP1細胞質、細胞核及細胞質/核的表達均呈正相關性（r=0.214，P=0.034；r=0.317，P=0.001；r=0.317，P=0.001）。β-catenin細胞質/核的表達和YAP1細胞質、細胞核、細胞質/核的表達均無相關性（r=0.096，P=0.344；r= 0.158，P=0.118；r=0.096，P=0.344）。見表3。

圖1　YAP1在大腸正常組織和大腸癌組織中的表達 ×200A：大腸正常組織；B：高分化腸癌組織；C：中分化腸癌組織；D：低分化腸癌組織

圖2　β-catenin在大腸正常組織和大腸癌組織中的表達 ×200A：大腸正常組織；B：高分化腸癌組織；C：中分化腸癌組織；D：低分化腸癌組織

表1　大腸癌組織中YAP1的表達與臨床病理參數之間的關系（n）

表2　大腸癌組織中β-catenin的表達與臨床病理參數之間的關系（n）

3　討論

Wnt信號通路是控制細胞增殖、分化和形態形成最重要的通路之一。β-catenin最早作為一種黏附因子被發現，主要由CTNNB1基因編碼。β-catenin可存在于細胞的不同部位：①和E-cadherin相互作用，定位于細胞膜；②定位于細胞質；③定位于細胞核。β-catenin是Wnt信號通路最重要的效應因子，其穩定性受糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）、結直腸腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）以及軸蛋白（andaxin）組成的蛋白復合體即APC復合體的調節。在WNT受體失活的情況下，β-catenin定位于細胞膜，APC復合體中的激酶會磷酸化胞質中的β-catenin從而使其迅速降解。相反，WNT與Frizzled和LRP共受體結合，可抑制APC復合體活性，使β-catenin聚集于細胞質進而轉移到細胞核與T細胞轉錄因子（TCF）/淋巴增強因子（LEF）形成復合體，刺激下游靶基因的轉錄。該信號通路參與干細胞和祖細胞的自我更新，其異常調節會與多種腫瘤發生有關，見于惡性黑色素瘤、肝癌、甲狀腺癌、卵巢癌及結直腸癌等［7-8］。多種惡性腫瘤中β-catenin蛋白的異常改變主要表現為β-catenin在細胞質/核的異常累積以及β-catenin膜表達的缺失。據研究［2］，90%以上的大腸癌中，Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵的調節因子都發生了突變，主要發生在APC或者β-catenin，從而引起該通路的激活，80%以上的大腸癌Wnt/β-catenin信號通路的激活，導致β-catenin表達于細胞核。本研究結果顯示β-catenin在大腸癌中的異位（細胞質/核）表達率為51.52%（51/99），顯著高于正常腸黏膜0%（0/30），提示β-catenin在大腸癌的發生發展中可能起重要作用。本研究中βcatenin的異位表達與腫瘤分化存在相關關系，提示β-catenin異常表達與細胞惡性轉化聯系緊密，βcatenin細胞核的表達與腸癌的浸潤深度相關，提示β-catenin異常表達與疾病進展聯系緊密。

表3　大腸癌組織中YAP1和β-catenin蛋白表達之間的關系（n）

YAP1是Hippo信號通路的關鍵的調節蛋白，其在細胞內的定位主要取決于是否磷酸化。當Hippo通路激活，會使YAP磷酸化，磷酸化的YAP與胞質中的14-3-3蛋白相互作用并聚集在胞質中。一旦Hippo通路失活，YAP就會轉移到細胞核，與TEAD結合，促進生長相關基因的表達，如結締組織生長因子（CTGF）及表皮生長因子家族成員之一的雙調蛋白（AREG）等［4］，提示Hippo信號通路通過磷酸化負調控YAP，從而調節細胞的增殖和凋亡，使其聚集在胞質，不能轉移到細胞核并促進靶基因的表達。在人類多種腫瘤中，如食道癌、胃癌、卵巢癌、結腸癌中均可見YAP過表達及核定位表達，YAP在細胞核的高表達可作為評判預后的指標［3，9-11］。本研究結果顯示YAP1在大腸癌中的陽性表達率為56.57%（56/99），顯著高于正常黏膜16.67%（5/30），提示YAP1在大腸癌的發生發展中可能起重要作用。Wang et al［12］應用免疫組化法發現YAP在腸癌中的表達與淋巴結轉移及TNM分期存在顯著相關性。而本研究中YAP1的表達與臨床病理因素間均無相關性，可能是由于選取病例數量有限，需通過擴大樣本量進一步研究。

有文獻［13］報道，Hippo信號通路的下調和βcatenin信號通路的上調有關，可見于大腸癌。這一相關關系主要是因為磷酸化的YAP可與胞質中的β-catenin結合從而阻止β-catenin的核轉移。有報道［14］顯示YAP誘導的腸的發育異常可促使β-catenin核定位的增加，暗示著Wnt通路的激活。研究［15］顯示人類大腸癌細胞中Wnt/β-catenin信號異常可促進YAP的表達。本研究結果顯示YAP1和β-catenin呈正相關性，主要體現在β-catenin細胞質的表達與YAP1細胞核及YAP1細胞質/核的表達呈正相關性；β-catenin細胞核的表達和YAP1細胞質、YAP1細胞核及YAP1細胞質/核的表達的表達呈正相關性。與上述報道的結果一致，提示YAP1和β-catenin在大腸癌的發生發展過程中存在協同的作用，也暗示了Hippo信號通路與Wnt/β-catenin信號通路在腸癌的發展過程中存在相互作用。但YAP1和β-catenin在大腸癌發生發展過程中相互作用的具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，YAP1和β-catenin的異常表達與大腸癌的發生發展有關，為進一步研究大腸癌發病的分子機制提供理論依據。

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Expression and relationship of YAP1 and β-catenin in colorectal carcinoma

Chen Shunhua1，2，Yin Yu1，2，Cao Liyu1，2，et al
（1Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Patholgoy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the expression of Yes-associated protein 1（YAP1）and β-catenin in colorectal carcinoma tissues and their association with the clinicopathological features of colorectal carcinoma patients. Methods The expressions YAP1 and β-catenin in human colorectal carcinoma and colorectal normal tissue（99 cases of human colorectal carcinoma，30 cases of colorectal normal tissues）were detected by immunohistochemistry Envision two step method.Results The positive rate of YAP1 in CRC（56.57%）was higher than that in normal mucosa（16.67%）（Χ2=14.704，P＜0.01）.The abnormal positive rate of β-catenin in CRC（51.52%）was higher than that in normal mucosa（0%）（Χ2=25.559，P＜0.01）.The expression of YAP1 showed no significant correlation with sex，age，differentiation，infiltration，lymph node metastasis and Duke′s period.The nuclear β-catenin expression was correlated with the differentiation degree and depth of invasion（Χ2=6.641，4.229，P＜0.05）.The cytoplasmic β-catenin expression was correlated with the differentiation degree（Χ2=6.761，P＜0.05）.The membranal β-catenin expression showed no significant correlation with clinicopathological parameters.The cytoplasmic β-catenin expression and nuclear β-catenin expression was postively correlated with the nuclear YAP1 expression and cytoplasmic/nuclear YAP1 expression（P＜0.05）.The nuclear β-catenin expression was postively correlated with the cytoplasmic YAP1 expression（P＜0.05）.Conclusion YAP1 and β-catenin proteins play important roles together in the carcinogehesis of CRC.The nuclear β-catenin expression may contribute to colorectal carcinoma prognosis judgement.

colorectal carcinoma；YAP1；β-catenin；immunohistochemistry

R 735.34

A

1000-1492（2016）06-0836-05

2016-03-23接收

國家自然科學基金（編號：81201536）；安徽省高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2013A150）

1安徽醫科大學病理學教研室，合肥 2300322安徽醫科大學第一附屬醫院病理科，合肥 230022

陳順華，女，碩士研究生；尹 玉，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：aydyinyu@aliyun.com；曹立宇，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：caoliyuhf@163.com