高效液相色譜法測定天女木蘭葉中游離酚和結合酚

高紅兵，杜風國，王 歡

(北華大學林業與生態環境省重點實驗室，吉林吉林 132013)

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高效液相色譜法測定天女木蘭葉中游離酚和結合酚

高紅兵，杜風國，王 歡

(北華大學林業與生態環境省重點實驗室，吉林吉林 132013)

[目的]進一步了解天女木蘭中酚類物質種類及含量。[方法]利用高效液相色譜儀對天女木蘭葉片中游離酚、結合酚和酯化酚進行定性定量測定。[結果]在10種檢測酚中，天女木蘭葉片中含有香豆酸和綠原酸2種游離酚，含有咖啡酸、香豆酸、香豆素和表兒茶素4種結合酚及香豆素和香豆酸2種酯化酚；各種形式的香豆酸廣泛存在于葉片中。[結論]該研究建立的高效液相色譜法測定天女木蘭葉中游離酚和結合酚的方法準確、可靠。

高效液相色譜；天女木蘭；游離酚；結合酚；酯化酚

酚類物質是植物體內一種重要的次生產物，其廣泛分布于植物葉、莖、皮、花和果實等多種器官中，對植物的葉片顏色、果實風味和品質有較大影響。近年來，人們發現酚類物質具有清除自由基、抗膜脂質氧化、預防心血管疾病、抗衰老、防癌等功效，越來越引起人們的重視[1-3]；同時酚類物質在植物體內具有抗病、防傷害、抗輻射作用[4]，如咖啡酸、兒茶酚、單寧酸、蘆丁和香豆酸等游離酚參與抗病反應[5]。植物抗病性與組織中酚類化合物的含量具有相關性[6]，酚類化合物能影響細胞膜透性和 ATP 形成，也能被多酚氧化酶和過氧化物酶催化氧化形成醌類化合物，作為殺菌劑在植物抗病中發揮重要作用。

天女木蘭(MagnoliasieboldiiK.Koch)又名小花木蘭，為木蘭科木蘭屬的落葉小喬木，其葉片含有大量芳香油及酚類物質，是非常具有開發利用價值的珍稀野生木本植物資源。有關木本植物酚類物質測定的研究報道較多，有氣相色譜法[7]和液相色譜法[8-10]，由于氣相色譜法樣品前處理繁瑣，所以液相色譜法應用較多。目前，關于天女木蘭葉片中游離酚和結合酚含量的研究鮮見報道。鑒于此，筆者在前人的HPLC測定酚類物質方法基礎上對流動相進行了部分改進，建立了10種游離酚的定量測定方法，旨在為天女木蘭的開發利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料。 2014年8月，樣品取自吉林省吉林市豐滿區四六五醫院成年天女木蘭成株，為完全展開、成熟健康葉片，液氮冷凍，放入-80 ℃低溫冰箱保存備用。

1.1.2主要儀器。高效液相色譜儀(日本島津公司)，系統配置為 SPD-M20A 二極管陣列檢測器、自動進樣器、LC-20AT泵。

1.1.3試劑與標準物質。色譜純甲醇、甲酸和超純水；沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、綠原酸、槲皮素、蘆丁兒茶素、表兒茶素和香豆素標準品均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.2方法

1.2.1色譜分析條件。色譜柱：C18反相色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流動相A泵為0.5%(體積分數)的甲酸水溶液，B泵為0.5%甲酸甲醇溶液；總流速0.8 mL/min，檢測波長為275 nm；B泵洗脫梯度：起始濃度為10%，15 min時增加至18%，35 min時增加到25%，45 min時增加到35%，再次濃度平衡15 min，60 min時增加到50%，65 min時增加到65%，75 min時增加到95%，隨后流速回落到初始濃度，并且在該濃度平衡分離柱10 min后進樣。

1.2.2定性定量測定。按照“1.2.1”的梯度洗脫條件，先進行10種標準游離酚的檢測，在最大吸收峰下條件利用外標曲線法制作各種酚的標準曲線，根據外標曲線計算出樣品中游離酚的含量。樣品中游離酚的定性采用標準樣品的保留時間與其UV圖譜比較確定樣品中酚類物質種類。

1.2.3多酚的提取。稱取樣品2 g低溫研磨，加正己烷 20 mL搖床振蕩15 min去酯 2次，加入甲醇-丙酮-水(體積比為7∶ 7∶ 6)提取劑 40 mL，于室溫下超聲20 min 提取3次，抽濾，合并3次抽濾液。濾液用于游離酚和酯化酚的提取，濾渣用于結合酚的提取。

將上述合并后的抽濾液于 40 ℃ 真空濃縮至水相，用4 mol/L HCl 調整溶液的 pH至2，離心，取上清液用 80 mL 正己烷去酯 2 次，用80 mL 等體積的乙酸乙酯-無水乙醚混合液萃取 3次，合并萃取液，于 30 ℃ 下真空濃縮至干，用甲醇溶液定容至 5 mL 得游離態酚，過 0.45 μm 微孔濾膜，供 HPLC 測定。將上述乙酸乙酯-無水乙醚萃取后所得的水相溶液與離心后沉淀物混合，加入 4 mol/L NaOH 溶液100 mL，于室溫下避光水解 4 h，其余操作同萃取游離酚得到酯化酚，過 0.45 μm 微孔濾膜，供 HPLC 測定。將甲醇-丙酮-水混合溶劑提取過濾后所得濾渣加入 4 mol/L NaOH 溶液 30 mL，于室溫下避光水解4 h，其余操作同萃取游離酚得到結合酚。游離酚、酯化酚和結合酚的提取參照文獻[11]，并略作改動。過0.45 μm微孔濾膜，供 HPLC 測定。

2　結果與分析

2.1標準樣品的測定結果按照“1.2.1”的色譜條件，10種標準酚的保留時間和最大峰吸收峰波長見表1。分離效果色譜見圖1。沒食子酸出峰最早，保留時間為9.79 min，其他依

表110種酚標準品的保留時間及最大吸收峰

Table 1Retention time and the maximum absorption wavelength of ten kinds of phenol standards

酚類物質Phenolics保留時間Retentiontime∥min最大吸收波長Maximumabsorptionwavelength∥nm沒食子酸Gallicacid9.79270兒茶素Catechin24.89278綠原酸Chlorogenicacid31.21327咖啡酸Caffeicacid32.39323表兒茶素Epicatechin36.66278香豆酸Coumaricacid45.23309阿魏酸Ferulicacid50.54322香豆素Coumarin54.13275蘆丁Rutin68.11255槲皮素Quercetin73.04374

次為兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、香豆素、蘆丁和槲皮素，槲皮素最后出峰保留時間為73.04 min。由于采用梯度洗脫，從75.00 min開始基線開始向上漂移。從分離效果看，8種酚分離效果良好，只有咖啡酸和綠原酸保留時間相差1.28 min，兩峰相距較近，但不影響定量測定。

注：1.沒食子酸；2.兒茶素；3.綠原酸；4.咖啡酸；5.表兒茶素；6.香豆酸；7.阿魏酸；8.香豆素；9.蘆丁；10.槲皮素。Note：1.Gallic acid；2.Catechins；3.Chlorogenic acid；4.Caffeic acid；5.Epicatechin；6.Coumaric acid;7.Ferulic acid,8.Coumarin；9.Rutin；10.Quercetin.圖1　10種游離標準酚分離色譜圖譜Fig.1　Chromatogram of ten kinds of the free phenol mixed standard

2.2線性關系及檢出限由表2可知，10種酚的相關系數均在0.99以上，說明在一定范圍內線性關系良好；綠原酸和蘆丁線性范圍較寬，分別達0.03～350.00和0.03～370.00 mg/L，而其余8種酚的線性范圍較窄，一般在0.02～100.00 mg/L。綠原酸的檢出限值最低為12.22 μg/L，表兒茶素最高為38.26 μg/L 。

表2　線性回歸方程、相關性系數、線性范圍及檢出限

2.3回收率按照“1.2.3”酚的提取方法，在空白液中加入標準酚然后提取，試驗設3個重復取平均值。由表3可知，香豆酸回收率最高為95.39%，其次為兒茶素、表兒茶素、阿魏酸、香豆素、蘆丁、槲皮素、咖啡酸和沒食子酸。綠原酸回收率最低為72.43%。相對標準偏差在0.98%～2.49%，說明該提取方法準確、可靠。

2.4樣品測定結果樣品中游離酚、結合酚和酯化酚的檢測色譜圖譜與10種標準品色譜圖譜比較見圖2，利用與標樣保留時間和UV圖譜比較進行定性，葉片中含有綠原酸和香豆酸2種游離酚(圖2A)，香豆酸的含量遠遠高于綠原酸；葉片中含有結合態咖啡酸、表兒茶素、香豆酸和香豆素4種酚，其中結合態咖啡酸和香豆酸含量較高(圖2B)；葉片中含有2種形態酯化酚，香豆酸和香豆素酯化酚(圖2C)。

表3　酚類標準物質的回收率

由表4可知，葉片中含有2種游離酚、2種酯化酚和4種結合態酚。游離酚有香豆酸和綠原酸，香豆酸的含量為5.310 mg/g，遠遠高于綠原酸0.750 mg/g的含量；結合態咖啡酸含量最高為1.480 mg/g，其次為結合態香豆酸含量為1.110 mg/g，結合態表兒茶素0.170 mg/g，結合態香豆素含量最低為0.014 mg/g；含有香豆素和香豆酸2種酯化酚，香豆酸酯化酚含量為0.570 mg/g，是香豆素酯化酚含量的50余倍。

3　結論與討論

該研究利用C18反相柱，以0.5%的甲酸水和甲酸甲醇溶液作為流動相，進行梯度洗脫，測定了天女木蘭葉片中酚類物質。結果表明：天女木蘭葉片中含有2種游離酚、4種結合酚和2種酯化酚；香豆酸普遍存在于3種形態酚中，在游離酚和酯化酚中香豆酸含量最高；在結合酚中結合態咖啡酸含量最高，其次是香豆酸。

注：A.游離酚；B.結合酚；C.酯化酚。Note：A.Free phenol；B.Combined phenol；C.Ester phenol.圖2　葉片中游離酚、結合酚和酯化酚與10種標準品圖譜的比較Fig.2　Comparison between the free phenol，combined phenol and ester phenol in leaves and ten standard substances

Table 4The determination results of phenolic compounds in leaves mg/g

酚類化合物Phenoliccompound游離酚Freephenoliccompounds酯化酚Esterphenoliccompounds結合酚Combinedphenoliccompounds沒食子酸Gallicacid000兒茶素Catechol000綠原酸Chlorogrnicacid0.75000咖啡酸Caffeicacid001.480表兒茶素Epicatechin000香豆酸Coumaricacid5.3100.5701.110阿魏酸Ferulicacid000蘆丁Rutin000槲皮素Quercetin000香豆素Coumarin00.0120.014

酚類物質的提取通常采用80%甲醇水溶液提取，主要由于甲醇對大部分游離酚具有良好的溶解性，同時能抑制酶的活性，防止在提取過程中游離酚被氧化。該試驗采用甲醇-丙酮-水(體積比為7∶7∶6)提取，主要是提取游離酚的同時兼顧提取結合酚和酯化酚。游離酚中咖啡酸、綠原酸、兒茶素和表兒茶素不穩定、易氧化分解，在提取過程中盡量在低溫避光環境下進行，利用旋轉薄膜濃縮時使用40 ℃以下溫度加熱，盡量降低氧化概率。從游離酚的回收率測定來看，香豆酸回收率最高，達95.39%，綠原酸回收率最低，為72.43%，相對標準偏差為 0.98%～2.49%，表明該提取方法準確、可靠。

利用HPLC測定酚類物質的報道較多。念紅麗等[8]利用HPLC測定了棗皮中12種酚類物質含量；孫洪圳等[9]利用HPLC測定了蘋果樹皮中酚類物質；沈丹紅等[10]使用HPLC-MS定性、定量測定了煙草中25種酚類物質。上述研究都采用甲醇和水為流動相，外加1%乙酸進行梯度洗脫，加入乙酸作用是防止酚類物質的羥基和羧基上的氫發生電離，使酚類物質保持不帶電荷狀態，從而達到良好的峰型及分離效果[12]。該試驗進行了改進，采用加入0.5%甲酸，甲酸與乙酸相比分子小、透性較好，可有效減小柱壓。從該試驗10種酚的分離效果及峰型看，均取得良好效果。

有關木本植物酚類物質測定有一些報道，測定材料以具有經濟價值的果實為主，天女木蘭是瀕危樹種，不但具有良好的觀賞性，而且具有一定的藥用價值。植物體內游離咖啡酸、香豆酸和綠原酸具有抗氧化、抑菌和抗病毒作用[13]。它們屬于酚酸類化合物，而且非常不穩定，易受外界溫度、酸性和光照等因素影響而發生降解[14]。該研究發現，天女木蘭葉片中含有多種酚類物質，在10種標準游離酚中檢測到2種，分別是香豆酸和綠原酸，香豆酸的含量遠遠高于綠原酸；含有4種結合酚分別是結合態咖啡酸、結合態香豆酸、結合態香豆素和結合態表兒茶素，結合態咖啡酸含量最高達1.48 mg/g，其次是結合態香豆酸含量，結合態表兒茶素和香豆素含量較低；酯化酚檢測到2種分別是香豆素酯化酚和香豆酸酯化酚，后者含量遠遠高于前者。天女木蘭葉片中香豆酸含量較高，不論在游離酚和結合酚和酯化酚中都含有。另外，該研究發現葉片中結合態咖啡酸含量較高，但游離態咖啡酸未檢出，而葉片中檢測有游離的綠原酸，未發現結合態綠原酸。木本植物體內的結合態酚類物質主要通過醚鍵、縮醛鍵和酯鍵與纖維素結合廣泛存在于植物細胞壁中。

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Determination of Free Phenol and Combined Phenol in Leaves ofMagnoliasieboldiiK. Koch by High Performance Liquid Chromatography

GAO Hong-bing, DU Feng-guo, WANG Huan

(Provincial Key Laboratory of Forestry and Ecological Environment, Beihua University, Jilin, Jilin 132013)

[Objective] To further understand the type and content of phenol inMagnoliasieboldiiK. Koch. [Method] High performance liquid chromatography (HPLC) was used to qualitatively and quantitatively measure the free phenol, combined phenol and ester phenol in leaves. [Result] Among the four detected phenol,M.sieboldiileaves contained two free phenols (coumaric acid and chlorogenic acid), four combined phenols (caffeic acid, coumaric acid and catechin, coumarin) and two ester phenols (coumarin and coumaric acid). Various forms of coumaric acid widely existed in leaves. [Conclusion] Detecting free phenol and combined phenol inM.sieboldiileaves by HPLC is accurate and reliable.

HPLC;MagnoliasieboldiiK. Koch; Free phenol; Combined phenol; Ester phenol

吉林省科技廳項目(20140101016JC)；吉林省教育廳項目(吉教合字2014第172號)。

高紅兵(1962- )，男，吉林吉林人，教授，從事植物生理學研究。

2016-05-03

S 789.4

A

0517-6611(2016)20-004-04