川丹通脈片中丹參酮ⅡA含量測定研究

汪 濤，胡衛東，李育芳，巴夏玲，程 波（.解放軍武漢療養院藥械科，湖北 武漢 430074；.華中科技大學同濟醫學院藥學院實驗室，湖北 武漢 430030）

川丹通脈片中丹參酮ⅡA含量測定研究

汪 濤1，胡衛東1，李育芳1，巴夏玲1，程 波2
（1.解放軍武漢療養院藥械科，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學同濟醫學院藥學院實驗室，湖北 武漢 430030）

目的：建立川丹通脈片中有效成分丹參酮ⅡA含量測定HPLC方法。方法：選用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-水（75∶25）為流動相；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃。結果：HPLC法測定丹參酮ⅡA不存在干擾，丹參酮ⅡA進樣量在1.486 ～ 44.570 μg·mL-1范圍內時，線性關系良好；加樣回收率為100.1%，RSD為1.37%。結論：該質量控制方法簡便、穩定、可靠，可作為川丹通脈片中丹參酮ⅡA的含量測定方法。

川丹通脈片；丹參酮ⅡA；高效液相色譜法；含量測定

川丹通脈片為解放軍武漢療養院配制的純中藥制劑，軍隊醫療機構制劑批準文號：廣制字（2013）F03002。該制劑由中藥川芎、丹參、海風藤、豬牙皂、地龍組成，采取中藥粉末與中藥提取浸膏混合后制粒，顆粒干燥后壓片的方法制備，屬于半浸膏素片。具有活血化瘀，祛痰開竅，擴張血管，增進心、腦動脈血流量的功效。用于治療心絞痛，心肌梗死，腦血栓形成等癥。為更好地控制產品質量，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對川丹通脈片中丹參所含丹參酮ⅡA進行了含量測定，為該制劑建立完善的質量標準提供理論參考。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；色譜柱為welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；LC-350A型超聲波中藥處理機（濟寧市市中區魯超儀器廠）。

丹參酮ⅡA對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110766-200619）。川丹通脈片（規格：0.3 g，批號150212、150305、150317）由解放軍武漢療養院提供。水為純水機凈化水（純水機型號Millipore Milli-Q Biocel型純水器）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 丹參酮ⅡA含量測定［1］

2.1色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以甲醇-水（75∶25）為流動相；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃。按丹參酮ⅡA色譜峰計算理論塔板數，應不得低于2000。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液 精密稱取丹參酮ⅡA 6.19 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（0.123 8 mg·mL-1）。再精密吸取對照品儲備液3 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為14.86 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取本品粉末約0.5 g（批號150212），精密稱定，置具塞棕色錐形瓶內，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）15 min，冷卻后稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液 取除去丹參以外的其它藥材，按確定的制備工藝生產陰性供試品。按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3專屬性實驗

將上述3種溶液各10 μL，分別進樣分析，色譜圖中，丹參酮ⅡA色譜峰峰形對稱，達到基線分離，陰性對照溶液無干擾，該方法專屬性良好，見圖1。

圖1　川丹通脈片中丹參酮ⅡA含量測定色譜圖A - 對照品，B - 供試品，C - 陰性對照；1 - 丹參酮ⅡAFig 1 The chromatograms of content determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tabletsA - reference substance， B - sample， C - negative reference substance；1 - tanshinoneⅡA

2.4線性關系的考察

分別精密吸取對照品儲備液（0.123 8 mg·mL-1）0.6、1.2、3、6、12、18 mL，置50 mL具塞棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的對照品溶液。按濃度由低到高的順序，依次精密吸取不同濃度的對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，測定丹參酮ⅡA峰面積。繪制標準曲線：縱坐標（Y）為色譜峰面積，橫坐標（X）為質量濃度；線性回歸方程為：Y = 0.974 0 X + 0.015 6，r = 1。結果表明：丹參酮ⅡA對照品在1.486 ～ 44.570 μg·mL-1范圍內，線性關系良好［2］。

2.5儀器精密度實驗

精密吸取同一供試品溶液（批號150212）10 μL，重復進樣6次，測定峰面積，RSD為0.23%。結果表明儀器精密度良好［3］。

2.6重復性實驗

取同一批供試品（批號150212）6份，分別按“2.2.2”項下方法制備，測定峰面積并計算含量，結果供試品中丹參酮ⅡA的平均含量為0.754 8 mg·g-1，RSD為0.67%［4］。

2.7穩定性實驗

取同一批供試品（批號150212），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、16、24 h進樣，記錄峰面積，測定峰面積值的RSD為0.52%。結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8加樣回收率實驗

分別精密吸取對照品儲備液（0.123 8 mg·mL-1）3、5、10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度的丹參酮ⅡA對照品溶液（濃度分別為3.714 μg·mL-1、6.190 μg·mL-1、12.380 μg·mL-1）。再精密稱取已知準確含量的同一批川丹通脈片（批號150212）共9份，分別精密加入上述不同濃度的丹參酮ⅡA對照品溶液25 mL，每個濃度制備3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示丹參酮ⅡA的平均回收率為100.1%，RSD 為1.37%［4-5］，詳見表1。

2.9耐用性實驗

分別精密稱取同一批號（批號150212）的川丹通脈片粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下，采用3種不同品牌的色譜柱，依法測定，結果如下：welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）：分離度 ＞ 5，理論塔板數15 715，含量為0.761 4 mg·g-1；Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）：分離度＞ 5，理論塔板數9019，含量為0.750 3 mg·g-1；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）：分離度＞ 5，理論塔板數15 094，含量為0.754 8 mg·g-1；RSD為0.74%，表明3種不同品牌色譜柱均能重現現有方法。

表1　加樣回收率實驗結果. n = 9Tab 1 The results of sample recovery rate test. n = 9

2.10供試品的含量測定

取本品3批，批號分別為150212、150305、150317，按正文“2.2”項下方法試驗，結果見表2。

表2　供試品中丹參酮ⅡA的含量測定結果Tab 2 The result of content determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tablets

3 討論

3.1含量測定指標成分的選擇

川丹通脈片由5味中藥材組成，現代藥理實驗證明川芎、丹參能擴張血管，增加心腦動脈血流量［6-12］，起到活血化瘀，行氣開竅的作用，共為君藥；地龍，清熱定驚，為臣藥；豬牙皂、海風藤有祛痰開竅功效，同為佐藥。在建立川丹通脈片中有效成分含量測定方法的過程中，根據川丹通脈片所含5味藥材所起作用及用量，分別對川芎、丹參中的有效成分進行含量測定實驗。在對川芎的有效成分阿魏酸進行含量測定實驗時，HPLC色譜圖中色譜峰峰形不對稱，峰形不標準，表明在測定阿魏酸含量的實驗過程中，存在較大干擾。因此，川丹通脈片不宜采用阿魏酸進行含量測定。

丹參為方中君藥，丹參酮ⅡA為丹參的專屬性成分。在測定丹參酮ⅡA含量時，含量測定及加樣回收實驗均不存在干擾，故選擇丹參酮ⅡA作為控制川丹通脈片質量的指標成分。

3.2流動相的選擇

《中華人民共和國藥典》2015年版一部中丹參項下測定丹參酮類含量，是進行HPLC梯度洗脫，由于設備條件有限，所以只采用高效液相色譜儀進行丹參酮ⅡA的含量測定。經反復實驗，選定以甲醇-水（75∶25）為流動相進行測定，結果顯示供試品溶液峰形較好，丹參酮ⅡA能夠達到基線分離，故最終采用此作為流動相。

3.3丹參酮ⅡA含量限度的確定

由于《中華人民共和國藥典》2015年版一部中對丹參中丹參酮類的含量有規定，根據實驗情況，選擇丹參酮ⅡA的含量為重點控制對象［13］。根據含量測定的結果及大量配制中的實際情況，建議川丹通脈片應含丹參酮ⅡA≥0.20 mg·片-1。

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Determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tablets

WANG Tao1， HU Wei-dong1， LI Yu-fang1， BA Xia-ling1， CHENG Bo2
（1. The Drug and Equipment Section of Wuhan Sanatorium of People's Liberation Army， Wuhan 430074， China； 2. The Schools' Laboratory of Pharmacy in Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China）

Objective: To establish a determination method of active ingredient in Chuandan Tongmai tablets. Methods: The Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used， with the mobile phase consisted of methanol-water （75∶25）. The detection wavelength was set at 270 nm， velocity of flow was 1.0 mL·min-1， the column temperature wa 35 ℃. Results: The tanshinoneⅡA was not intervened with other impurities in this HPLC method. The calibration curve was linear when the concentrations of tanshinoneⅡA were within the range of 1.486 - 44.570 μg·mL-1. The average recovery was 100.1% （RSD = 1.37%）. Conclusion: The method is simple， stable， reliable， and can be adopted as the quality control method.

Chuandan Tongmai tablets； TanshinoneⅡA； HPLC； Content determination

R917

A

1672 - 8157（2016）04 - 0214 - 03

2015年軍隊醫療機構制劑標準提高計劃項目（14TG0199）

汪濤，男，主管藥師，研究方向：醫院藥學、中藥制劑。E-mail：taidi1127@126.com

2016-03-04

2016-05-23）