食用栝樓種苗雌雄性別的DNA鑒定技術初步研究

2016-09-09 08:30:10金關榮駱霞虹楊曉伶王亦斌朱云國陳常理浙江省農業科學院花卉研究開發中心浙江杭州30同濟大學生命科學與技術學院上海0009

浙江農業科學 2016年7期

金關榮，程　舟，駱霞虹，楊曉伶，王亦斌，李　珊，朱云國，陳常理*（.浙江省農業科學院花卉研究開發中心，浙江杭州 30；.同濟大學生命科學與技術學院，上海 0009）

金關榮1，程舟2，駱霞虹1，楊曉伶2，王亦斌2，李珊2，朱云國2，陳常理1*
（1.浙江省農業科學院花卉研究開發中心，浙江杭州 311202；2.同濟大學生命科學與技術學院，上海 200092）

應用ISSR分子標記構建食用栝樓雌雄植株的DNA指紋圖譜，獲得與食用栝樓雌雄性別相關的分子標記，可準確、有效地鑒定食用栝樓種苗雌雄性別，為栝樓產業的可持續發展提供技術支撐。

食用栝樓；種苗；雌雄性別；ISSR；鑒定

文獻著錄格式：金關榮，程舟，駱霞虹，等.食用栝樓種苗雌雄性別的DNA鑒定技術初步研究［J］.浙江農業科學，2016，57（7）：1066-1068.

栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）是葫蘆科（Cucurbitaceae）栝樓屬（Trichosanthes L.）多年生草質藤本植物，其根、果實、果皮、種子均可入藥，是我國的重要藥用植物資源［1］。食用栝樓，又叫仁栝樓，俗稱吊瓜，是野生栝樓的栽培種，其種子富含脂肪和蛋白質、味香爽口、油而不膩，具有較高的食用價值。目前，在長三角地區尤其是浙江省長興、麗水、江蘇省宜興、常州等縣市栝樓已廣泛種植，僅長興縣今年的種植面積就近6 667 hm2，取得了良好的經濟效益。

栝樓是雌雄異株植物，開花前雌、雄株間無明顯的形態差異，雌雄株難辯。在栝樓栽培生產中雌、雄株的合理搭配在9∶1左右，而用種子繁殖栝樓時其幼苗的雌雄比例約為3∶7，目前產區多采用開花后人工去除雄株，以控制雌雄株比率。栝樓雌雄株比例失調直接影響產量和經濟效益，不僅對土地、資源、人力等方面都造成較大浪費，而且已經成為制約食用栝樓產業發展的重要因素。

DNA指紋鑒定技術是近十幾年發展起來的研究生物種群遺傳多樣性的有效技術，可對種、品種甚至個體間的微小差異進行有效的標記和鑒定，如限制性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）、擴增性酶切片段長度多態性（AFLP）和微衛星標記（SSR）等。這些方法由于具有靈敏、所需樣品量少、不受材料外形的影響、直接檢測樣品的遺傳物質DNA等特點，現已被廣泛用于基因定位、醫學鑒定以及種質資源的鑒定和保護等領域。特別是對于檢測生物個體間的細微差別具有其他方法難以比擬的優越性。

ISSR（inter-simple sequence repeat）簡單序列重復區間擴增多態性，是利用生物基因組中常出現的簡單序列重復SSR（simple sequence repeat）設計引物，檢測多態性的一種分子標記。ISSR分子標記技術具有操作簡單、無須預先知道DNA序列、比RAPD標記更為靈敏、穩定且實驗重復性好等優點［2-4］。

以往對栝樓的研究較少，僅對其生物學特性、栽培技術、病蟲害防治、遺傳多樣性、內含物等方面有少量報道［3-7］，對栝樓雌雄株DNA鑒定的研究尚屬空白。因此，本研究嘗試應用ISSR分子標記構建栝樓雌雄植株的DNA指紋圖譜，尋找與性別相關的分子標記，優化操作程序，建立準確、有效、實用的食用栝樓種苗雌雄性別鑒定技術，為栝樓產業的可持續發展提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1材料

2005年5月在浙江省農業科學院花卉研究開發中心苗圃，從已知雌雄性別的3年生食用栝樓植株中選取6株雄株和10株雌株的新鮮葉片，用于DNA指紋圖譜分析。另選已知雌雄性別的2年生食用栝樓種苗30株用于驗證實驗。

1.2基因組DNA的提取

取上述各栝樓植株的新鮮嫩葉0.2 g，用液氮研磨后轉入離心管中，加入600μL預熱的CTAB緩沖液（2%CTAB、1.4 mol·L-1NaC1、0.2%β-巰基乙醇、100 mmol·L-1Tris-HC1、20 mmol·L-1EDTA，pH值8.0），65℃保溫1 h。加入600μL氯仿/異戊醇混合液（體積比24∶1），輕搖混勻5 min，室溫12 000 r·m in-1離心10 min。取上清，加入500μL氯仿/異戊醇混合液（24∶1），輕搖混勻10 m in，12 000 r·m in-1離心10 m in。取上清，加入1/10體積的3 mol·L-1NaAc和2倍體積的預冷的無水乙醇，顛倒混勻后在-20℃中保存30 m in。10 000 r·min-1離心5 m in，取沉淀，用70%乙醇清洗，5 000 r·min-1離心5 min。取沉淀干燥后用100μL TE緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HC1、1 mmol·L-1EDTA，pH值8.0）溶解，用0.7%的瓊脂糖凝膠檢測DNA質量。

1.3ISSR引物篩選和PCR擴增

選擇雌雄各2株的4個DNA樣品篩選14條ISSR引物，即The University of British Columbia（UBC）SSR Primer（RAPD）Synthesis Project Oligonucletide Set 100/9（表1）。反應體系20μL含2 mmol·L-1MgC12、0.25 mmol·L-1dNTPs、0.2μmol·L-1引物、10 ng模板、1×buffer和0.75 U Fx Taq DNA聚合酶（TaKaRa）。使用Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀進行擴增反應，擴增條件為94℃預變性5 min；40個循環：94℃變性45 s，48～55℃退火45 s（退火溫度隨引物變化見表1），72℃延伸45 s；最后72℃延伸10 min。

表1　本研究所用的ISSR引物

擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離（以100 V恒壓電泳35 min），以100 bp DNA Ladder Plus（MBI Fermentas）作為分子量標準，用1μg· m L-1溴化乙啶染色后于UVP-GDS8000自動成像儀中拍照、觀察、記錄并保存電泳圖片，構建栝樓雌雄植株的DNA指紋圖譜。

2　結果與分析

2.1食用栝樓雌雄株的ISSR指紋圖譜的構建

用已知雌雄性別的栝樓DNA樣品從14條ISSR引物中篩選出8個擴增條帶清晰、重復性好的引物，對所有樣本進行擴增。其中引物826和861兩條引物對已知雌雄性別的栝樓的DNA擴增結果表明，栝樓雌雄植株在ISSR指紋圖譜上表現出明顯的差異。在ISSR指紋圖譜（引物826）上，栝樓雌株在2 100 bp處出現特征性條帶，栝樓雄株則在1 100 bp處出現特征性條帶（圖1）。在ISSR指紋圖譜（引物861）上，栝樓雌株在1 400和1 000 bp處出現特征性條帶，栝樓雄株則在700 bp處出現特征性條帶（圖2）。根據栝樓雌雄株在ISSR指紋圖譜上的特征性條帶，可對栝樓種苗的雌雄性別進行早期鑒定。

圖1　食用栝樓種苗雌雄植株的ISSR指紋圖譜（引物826）

2.2食用栝樓種苗雌雄性別鑒定

根據構建的栝樓雌雄株的ISSR指紋圖譜及其特征性條帶，對栝樓種苗的雌雄性別鑒定的可靠性進行了驗證實驗，對已知雌雄性別的數十株栝樓種苗進行了DNA鑒定。圖3展示的是用ISSR引物826擴增出的食用栝樓種苗（雌株）及對照樣品栝樓雄株、雌株、野生株的指紋圖譜，結果食用栝樓種苗雌雄性別鑒定100%成功。同樣，用ISSR引物861擴增出的指紋圖譜也可以成功鑒定食用栝樓種苗的雌雄性別（圖2）。

3　小結

食用栝樓雌雄植株的ISSR-DNA指紋圖譜差異明顯，并獲得與雌雄性別相關的特征性條帶。根據已構建的栝樓雌雄植株的ISSR指紋圖譜和特征性條帶，可準確、有效地將栝樓種苗的雌雄性別鑒定出來。本研究結果為食用栝樓雌雄株的鑒別、雌雄株合理搭配供應及配比栽培提供技術保障，對栝樓產業的可持續發展具有重要意義及應用前景。