水稻粳粳交后代花藥培養技術的初探

段　敏，謝留杰，唐興國，黃善軍，潘曉飚*（.臺州市農業科學研究院作物研究所，浙江臨海 37000；.臺州市作物遺傳育種重點實驗室，浙江臨海 37000）

水稻粳粳交后代花藥培養技術的初探

段敏1，2，謝留杰1，唐興國2，黃善軍1，潘曉飚1，2*
（1.臺州市農業科學研究院作物研究所，浙江臨海 317000；2.臺州市作物遺傳育種重點實驗室，浙江臨海 317000）

以甬粳13-54/丙13-07和甬粳13-54/丙04-08（分別編號F2-17和F2-19）2個水稻粳粳交F2代為試驗材料，通過改變培養基中碳源、有機營養物、激素、活性炭等成分配比，建立一套適用于本生態區粳稻育種材料的花藥培養體系。結果表明，M 8+6%麥芽糖+2 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1KT+1 mg·L-1NAA+ 100 mg·L-1脯氨酸+500 mg·L-1谷氨酰胺+100 mg·L-1水解酪蛋白為誘導培養基效果較好，2種材料的花藥誘導率分別為5.56%和12.74%；分化培養基中KT∶6-BA=1∶4時可促進愈傷組織萌發出更多的綠點，綠點率可達47.42%。另外無論是愈傷組織誘導率還是綠點萌發均顯示F2-19的花藥培養效率高于F2-17。

水稻；花藥；愈傷組織；活性炭；有機營養物

文獻著錄格式：段敏，謝留杰，唐興國，等.水稻粳粳交后代花藥培養技術的初探［J］.浙江農業科學，2016，57（7）：1045-1049.

植物花藥培養技術已成為當今生物技術育種中較為成熟實用的育種技術。自1964年印度德里大學的Guha和Maheshiwari從毛葉曼陀羅花藥培養中獲得單倍體植株后，相繼有煙草、水稻、小麥等植物成功獲得單倍體植株［1］。由于單倍體植株經加倍后可以獲得純合二倍體，在育種上可快速獲得穩定的遺傳后代，故花藥培養技術逐漸受到各國育種家的重視，目前在生產實踐中已體現出巨大的價值。我國的水稻花藥培養技術研究始于20世紀70年代，至今已取得一系列可喜的成果，選育出多個水稻花培品種并被廣泛應用［2-3］。除了選育花培品種，水稻花藥培養還被成功應用在核質互作雄性不育系的提純復壯［4-5］、光溫敏核不育系的選育［6-8］及品種改良［9］等多個領域中。

盡管水稻花藥培養技術水平日益提高，但實際操作中由于基因型差異、培養基種類差異以及培養環境等因素的影響，往往難以獲得較大的再生植株群體，使后代選擇受到較大的限制［10］。因此，提高花藥培養的誘導效率、擴大花培后代群體是水稻花藥培育種成敗的關鍵。本研究選擇2個水稻粳粳交后代作為試驗材料，通過改變誘導培養基碳源、有機營養物、活性炭等成分，探索出一套適用于本生態區粳稻育種材料花藥培養體系，為日后該地區水稻育種的發展提供技術支持。

1　材料與方法

1.1供試材料

以甬粳13-54/丙13-07雜交F2代和甬粳13-54/丙04-08雜交F2代2個水稻品系為試材，分別編號為F2-17和F2-19，均由臺州市農科院作物所選育，種植于臺州市農科院小溪基地。

本試驗于2015年9—12月在本院進行。待試驗材料生長至孕穗期，劍葉葉枕與倒二葉葉枕距離5 cm左右時，于陽光充沛、天氣晴朗的午后從大田中選取健壯無病斑的水稻主莖或第一分蘗幼穗，保留2片葉子，帶回實驗室用1%的I2-KI溶液鏡檢。選取小孢子發育處于單核早中期的穗子，經75%乙醇表面擦拭后，用濕紗布及塑料膜包好放入冰箱冷藏（7℃）8～10 d。

1.2花藥接種及愈傷組織誘導

將低溫處理后的幼穗以枝梗為單位分開，每15～20支為1束浸入次氯酸鈉飽和溶液中消毒10～15 min，超凈工作臺上無菌水沖洗3～4次。在無菌條件下用鑷子將花藥小心取出，接種于固體培養基上。每個培養皿直徑為6 cm，接種花藥80～100枚。（26±2）℃條件下暗培養誘導出愈傷組織。

1.3愈傷組織分化和植株再生

待花藥膨脹、愈傷組織從花藥中長出后，從第25～70天，分次將直徑大小在1～3 mm左右的愈傷組織轉移至分化培養基中誘導綠苗分化，光照條件為2 000 1x，12 h·d-1，溫度設置（26±1）℃。待幼苗長至2～3 cm時移入生根培養基中生根，統計綠苗率及白苗率。待苗長至7～8 cm時，打開瓶蓋煉苗3 d，再移入溫室。

1.4培養基類型

愈傷組織誘導的培養基以M8為基礎培養基，加入6%麥芽糖或3%麥芽糖+3%蔗糖作為碳源。激素種類包括2，4-D（2.0 mg·L-1），KT（0.5 mg·L-1），NAA（1.0 mg·L-1）。以0.3%植物凝膠固化，pH調節至5.8左右。另據需求加入氨基酸、有機營養物、活性炭等。誘導培養基具體成分及含量見表1。

表1　愈傷組織誘導培養基中各營養成分的組合和配比

愈傷分化培養基以MS作為基礎培養基，加入6%麥芽糖，脯氨酸100 mg·L-1，谷氨酰胺500 mg·L-1，酸水解酪蛋白100 mg·L-1，并以0.3%植物凝膠固化，調節pH值至5.8左右。激素種類的成分及含量詳見表2。

表2　愈傷組織分化培養基中各營養成分的組合和配比mg·L-1

生根培養基的主要成分為1/2 MS基礎培養基中加入2%蔗糖，激素種類包括IBA（0.5 mg· L-1）和多效唑（4.0 mg·L-1），另外加入0.3%活性炭，以0.3%植物凝膠固化，pH調節至5.8左右。

所有培養基采用0.11 MPa、121℃高溫高壓滅菌20 m in，冷卻后備用。

1.5統計分析

花藥出愈率/%=愈傷組織總數/接種花藥數×100；

綠點率/%=出綠點的愈傷數/愈傷組織總數×100；

綠苗率/%=綠苗個數/愈傷組織總數×100；試驗數據用Exce1統計軟件分析。

2　結果與分析

2.1誘導培養基的成分對花藥愈傷組織誘導的影響

試驗設計了4種不同成分配比的誘導培養基。從表3可以看出，2種水稻花藥在誘導培養基R1、R3上基本未誘導出愈傷組織，在R2、R4培養基上均誘導出愈傷組織。比較R1、R2的結果，說明混合碳源（麥芽糖+蔗糖）的效果優于單一麥芽糖碳源。R3與R4相比，不含活性炭的R4能夠誘導出愈傷組織，說明活性炭在誘導過程中不是必須的。綜合來看，混合碳源的誘導效果好，而外加有機物（如氨基酸、水解蛋白等）可能與活性炭有所沖突，需避免同時使用。至于混合碳源與有機物同時使用的效果是否優于單一碳源（R4），還需進一步分析。

表3　不同誘導培養基對水稻花藥出愈率的影響

2.2分化培養基中激素含量對綠點率及綠苗率的影響

試驗設計了2種分化培養基，二者主要不同在于激素KT與6-BA的含量比例有所差異。由于R1、R3上基本沒有長出愈傷組織，故以R2、R4誘導培養基上轉移的愈傷組織數分析綠點率、綠苗率。

從表4看出，2種分化培養基上的愈傷組織均能萌發出綠點，而D2的綠點率高于D1，說明KT∶6-BA=1∶4的激素比更有利于愈傷組織的分化。大多數愈傷組織轉移至分化培養基后會褐化，這是正常現象。但隨著時間推移，褐化程度越發嚴重，使得原本有綠點的部位也隨之褐化。試驗結果未能得到一株綠苗。

表4　不同分化培養基對水稻花藥愈傷組織綠點率的影響

2.3基因型對花藥培養效率的影響

供試的2種水稻品系均為粳粳交的F2代，父本相同，母本不同。從表3看出，F2-17的花藥在R2上誘導出的愈傷組織較多，F2-19在R4上能夠誘導出更多的愈傷組織，說明不同基因型的花藥培養效率不同。由于R1、R3的誘導率極低，故以R2、R4誘導培養基上接種的花藥分析兩個水稻品系的花藥培養效率。如表5所示，無論是出愈率還是綠點率F2-19均比F2-17高，表明F2-19的花藥培養效率高于F2-17。

表5　不同水稻基因型的花藥培養效率對比

3　討論

3.1培養基成分對花藥培養效率的影響

水稻花藥培養的培養基包括基本培養基、碳源、激素、瓊脂以及其他成分等。經過大量的試驗和比較，目前得到普遍適用于水稻花藥培養的基礎培養基有適合粳稻的N6［11］、秈稻的合5［12］，以及對粳秈稻均有較好效果的通用［13］和M8［14］等。各種基本培養基的主要差別在于比例不同。本研究所用的M8培養基的摩爾比為3.5∶28，低于N6的7∶28，與郭書巧等［14］分析的水稻秈粳交后代及其親本的花藥培養技術使用的基本培養基一致，2種基因型的水稻花藥愈傷誘導率為5.56%～12.74%，誘導效果較好。

本研究設計了4種不同成分配比的誘導培養基，結果顯示，混合碳源（麥芽糖+蔗糖）的誘導效果優于單一碳源（麥芽糖），這與朱永生等［15］提出混合使用蔗糖和麥芽糖對出愈率及培養力的改善效果更佳這一說法相符合。Tara D［16］指出水解酪蛋白等有機物的添加可以增加花藥培養力，而谷氨酰胺、丙氨酸等有助于愈傷組織的形成。試驗中培養基R4以麥芽糖作為單一碳源，添加一定含量的有機營養物（脯氨酸，谷氨酰胺及水解酪蛋白）后也顯示出較好的誘導效果，說明外加氮源可以提高花藥愈傷誘導率。

外源激素是促進愈傷組織誘導和分化的重要因素。許多試驗證明，多激素配比使用比單一激素的誘導和分化效率高［14，17-18］，采用復合啟動因子誘導愈傷組織可促進培養力低的材料的愈傷誘導和綠苗分化。本試驗中誘導培養基使用2，4-D+KT+ NAA的混合激素，愈傷組織誘導率超過5%；分化培養基使用KT+6-BA+NAA的混合激素，能夠促進較多的綠點產生，說明混合激素適用于粳粳交后代花藥培養體系。

活性炭具有良好的吸附能力，至今已大量用于林木、禾谷類、蔬菜及其他經濟作物的植物組織培養。有研究表明，加入適量的活性炭，能夠吸附離體培養中的抑制物并降低玻璃苗的產生頻率，但同時也會吸收培養基中的營養物質［19］。本試驗中前3種誘導培養基均加入0.15%的活性炭，但僅R2有愈傷組織長出；相對應的未加活性炭的R4愈傷組織誘導效率顯著提高，說明活性炭在本試驗愈傷組織的誘導過程中不是必須的，且在添加有機營養物的條件下不需加入活性炭。綜合來看，適宜本試驗中的2種粳粳交后代的花藥愈傷組織誘導培養基是M8+6%麥芽糖+2，4-D+KT+NAA+脯氨酸+谷氨酰胺+水解酪蛋白。今后試驗中可以嘗試同時使用混合碳源+有機營養物的誘導方法。

3.2愈傷組織褐化影響綠苗得率

褐化現象是指在外植體誘導初分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養基釋放褐色物質以致培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象［20］。本試驗中愈傷組織轉移至分化培養基后約10 d開始有綠點產生。隨著時間推移，愈傷組織開始褐化（培養基并未變褐色）且褐化程度愈發嚴重，最終導致包括綠點在內的愈傷組織均褐化死亡，沒有分化出幼苗。顯然愈傷組織的褐化是沒有分化出幼苗的重要原因，如何降低愈傷組織的褐化程度是解決低出苗率的關鍵。

引起褐化現象的因素很多，包括材料選擇、培養基成分和形態、光溫培養條件等［21］。試驗中2 000 1x、12 h·d-1的光照條件以及（26±1）℃的溫度設置可能不適宜綠苗的分化，需要考慮進一步減少光照并適當降低溫度。盡管有報道顯示，添加氨基酸能夠提高綠苗分化率并減少愈傷組織的褐化［14，22］，但本試驗中的有機營養物的添加并未促進綠苗的分化。黃翠紅等［23］在研究水稻秈型恢復系花藥培養時提出，誘導培養基中有機物的添加雖然有利于愈傷組織的誘導，但同時對愈傷組織的后續分化存在一定程度的負效應。另外，添加活性炭能降低培養基的透光率，提高愈傷組織的分化率［22］。綜合來看，今后試驗中可將有機營養物、活性炭作為分化培養基的變量進行分析。

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（責任編輯：張瑞麟）

S511

B

0528-9017（2016）07-1045-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160727

2016-03-08

臺州市農業類一般項目（15ny04）；臺州市院地合作項目（TYD-001-2）；浙江省9410計劃資助項目

段 敏（1986—），女，安徽合肥人，農藝師，博士，主要從事水稻抗逆分子育種及組織培養工作，E-mai1：biyutianshi929 @sina.com。

潘曉飚（1966—），男，高級農藝師，E-mai1：tzxbpan@163.com。