山茶油HPLC-DAD指紋圖譜研究

賀加媛，章　樂，陳靜君，阮雙燕，陳智鵬，上官海燕，饒桂維*（.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 3005；.杭州云邁健康管理有限公司，浙江杭州 30000）

山茶油HPLC-DAD指紋圖譜研究

賀加媛1，章樂1，陳靜君1，阮雙燕1，陳智鵬1，上官海燕2，饒桂維1*
（1.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310015；2.杭州云邁健康管理有限公司，浙江杭州 310000）

為建立山茶油的高效液相指紋圖譜，并結(jié)合理化性質(zhì)指標(biāo)構(gòu)建山茶油真?zhèn)舞b別體系，文章采用國標(biāo)對山茶油樣品進行酸價、過氧化值和碘值等理化性質(zhì)測定，標(biāo)記出超標(biāo)樣品后，采用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 nm，5μm），以乙腈和1%磷酸梯度洗脫，流速1 m L·min-1，進樣量為10μL。以DAD為檢測器，在230、292 nm波長下檢測，測定10批次不同產(chǎn)地的山茶油，并應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》計算其相似度。文章首次建立了山茶油HPLC-DAD特征指紋圖譜共有模式，山茶油的最高相似度為0.923。該方法重現(xiàn)性好，具有一定的專屬性，可作為摻假山茶油鑒別的依據(jù)。

山茶油；理化性質(zhì)；高效液相色譜指紋圖譜

文獻著錄格式：賀加媛，章樂，陳靜君，等.山茶油HPLC-DAD指紋圖譜研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1115-1118.

油茶是一種多年生木本植物，四季常青，果實的含油率高，是山茶科山茶屬木本植物。山茶油含有豐富的單不飽和脂肪酸油酸和少量的亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸，以及豐富的維生素E、β-胡蘿卜素、磷脂等。一些不法生產(chǎn)者，銷售商為了牟取暴利，往山茶油中摻入其他油脂以次充好［1-3］。

DB33/T 735—2009摻假山茶油定性鑒別氣相色譜法采用的是氣相色譜法，針對山茶油中摻雜菜籽油、大豆油和棕櫚油的鑒別方法，該標(biāo)準(zhǔn)已不能適應(yīng)目前的鑒別需求。因此我們首先參照GB/T 5009.37—2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法、GB/T 9696—2008動植物油脂水分和揮發(fā)物含量測定、GB/T 5532—2008動植物油脂碘值的測定等進行酸價、過氧化值和碘值的測定，對油樣進行初步的排查；接著采用常規(guī)的紫外/可見光分光光度計進行光譜掃描，找出多數(shù)山茶油的共用紫外可見吸收峰；在選定共有吸收峰后，以HPLC-DAD為檢測設(shè)備，進行該波長下的樣品測定，對流出峰運用中藥指紋圖譜軟件進行相似性判定［5-6］。

1　材料與方法

1.1材料

材料。試驗共選取了浙江、湖南、江西及廣西等出產(chǎn)的共10批山茶油樣品，其樣品編號、來源地見表1。

供試山茶油樣品來源地及編號。廣西河池、浙江麗水、浙江衢州、浙江紹興、浙江杭州、安徽績溪、江西南昌、福建三明、湖南岳陽、廣東韶關(guān)分別用S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9和S10表示。

儀器。PL402-L電子天平、KQ5200DE超聲波清洗機、L6S紫外分光光度計、Agilent 1100高效液相色譜儀。

試劑。無水乙醚、冰乙酸（杭州化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇、硫代硫酸鈉（天津永大化學(xué)試劑公司），氫氧化鉀（杭州蕭山化學(xué)試劑廠），三氯甲烷（衢州巨化集團），碘化鉀（99.0%，西隴化工）；可溶性淀粉、正己烷、磷酸（永華化學(xué)科學(xué)有限公司），韋氏試劑（Shanghai Macklin）；異丙醇、甲醇（美國天地公司），乙腈（天津市四友精細化學(xué)品有限公司）。

1.2方法

1.2.1理化性質(zhì)考查

根據(jù)國標(biāo)《GB/T 5009.37—2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》、《GB/T 5532—2008動植物油脂碘值的測定》對10個山茶油樣品進行酸價、過氧化值、碘值等指標(biāo)進行測定并對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.2提取溶劑

稱取0.6 g山茶油，取4份，各置于10 m L容量瓶中，分別加入甲醇、乙醇、乙腈和正己烷溶解，然后稀釋至刻度，取適量溶液，以0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。通過色譜分析確定提取溶劑類型。

1.2.3色譜分析的波長

稱取0.1 g山茶油于10 m L容量瓶，用環(huán)己烷定容至刻度，濃度是0.01 g·m L-1，將樣品溶液置于比色皿中，利用紫外可見光分光度計采集樣本光譜，掃描波長范圍為200～320 nm。每個樣品采集1次，采集時間，掃描次數(shù)1次。

1.2.4色譜流動相

為了確定出較好的分離條件，分別考查甲醇-水、乙腈-水、乙腈-不同比例磷酸溶液的流動相對色譜分析結(jié)果的影響，從而最終確定試驗的流動相。

1.2.5色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）和1%磷酸（B）；梯度洗脫：0～20 min，95%A，5%B；20～50 min，100%A；檢測波長為：230 nm、292 nm；進樣量：10μL；流速為：1 m L·m in-1；柱溫：30℃。

1.3方法學(xué)考查

1.3.1穩(wěn)定性實驗

取S4供試品1份，按1.2.5節(jié)的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，記錄色譜圖，其各共有峰相對保留時間、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于3.0%，表明方法的穩(wěn)定性能良好。

1.3.2精密度實驗

取S4供試品1份，按1.2.5節(jié)的色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算其相對保留時間及相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于3.0%，表明方法的精密程度良好。

1.3.3重復(fù)性實驗

取S4供試品6份，每份2 m L，平行制得6份供試品溶液，按1.2.5節(jié)的色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算其共有峰相對保留時間、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于3.0%，表明試驗方法的重復(fù)性能良好。

1.4樣品測定

取10批山茶油樣品，按1.2.2節(jié)的方法制備供試品溶液，在1.2.5節(jié)的色譜條件下進樣檢測，記錄色譜圖。

1.5指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件對各個樣品的高效液相指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理，生成對照指紋圖譜（S1）并計算相似度。

2　結(jié)果與討論

2.1理化性質(zhì)

根據(jù)國標(biāo)《GB/T 5009.37—2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》、《GB/T 5532—2008動植物油脂碘值的測定》對10個山茶油樣品的酸價、過氧化值、碘值等指標(biāo)進行測定（表1）。根據(jù)前述國標(biāo)規(guī)定：山茶油的過氧化值≤6 g·100 g-1，酸價≤4 mg·g-1，碘值為83～89 g·100 g-1。由表1可知10個樣本的酸價皆符合要求。但S1、S7、S10號的過氧化值偏高，S6、S7、S10號的碘值偏高。初步推測S1、S7、S10號山茶油有可能被氧化。

表1　十批山茶油的酸價、過氧化值、碘值

2.2測定波長確定

利用紫外可見光分光度計采集樣本光譜，見圖1。試驗發(fā)現(xiàn)所有樣品在200～247 nm色譜峰較多，峰信號較長，而在230 nm處，10個樣品的峰吸收較長，且干擾少。有研究發(fā)現(xiàn)山茶油中含豐富的維生素E，本試驗則以維生素E為參照峰之一。故確定230 nm和292 nm（維生素E的吸收波長）作為試驗的測定波長。

2.3色譜流動相

在甲醇-水、乙腈-水、乙腈-不同比例磷酸溶液的流動相的色譜分析比較試驗中，發(fā)現(xiàn)乙腈-1%磷酸溶液作為流動相的各峰分離效果較好，色譜峰形較好，經(jīng)多次試驗得出較理想的梯度洗脫條件，故選擇乙腈-1%磷酸溶液作為試驗的流動相。

2.4指紋圖譜的建立及分析

2.4.1不同產(chǎn)地山茶油指紋圖譜的建立

取1～10號樣品油，按1.2.2節(jié)的方法制備供試品溶液，精密吸取各溶液10μL注入高效液相色譜儀，按照1.2.5節(jié)的色譜條件測定，記錄各樣品在50 m in內(nèi)的指紋圖譜。其中在230 nm波長下，S2、S4、S5、S9號樣品的總峰數(shù)為11個，8個共有峰被標(biāo)記，匹配后的圖譜見圖2。在292 nm波長下，總峰數(shù)為5個，3個共有峰被標(biāo)記，以維生素E為參照峰（圖3），匹配后的圖譜見圖4。

圖1　樣品紫外光譜掃描圖

圖2　S2、S4、S5、S9號樣品的指紋圖譜

圖3　維生素E的對照圖譜

2.4.2相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件對各個樣品的高效液相指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理，生成對照指紋圖譜（S1）并計算相似度。根據(jù)相似度分析結(jié)果，在230 nm波長下，S2、S4、S5、S9號樣品油的相似度大于0.8，結(jié)果見表2。在292 nm波長下，S1和S7號樣品與其他8個樣品的相似度存在明顯差異，結(jié)果見表2。

圖4　10批樣品的指紋圖譜

表2　230 nm和292 nm波長下相似度評價

3　小結(jié)

之前的文獻報道及地方標(biāo)準(zhǔn)皆是將山茶油樣品直接進行試驗，未先對樣品進行酸價、過氧化值和碘值測定，篩選出過氧化及酸敗的樣品，導(dǎo)致試驗的假陽性結(jié)果偏高。本實驗在前人基礎(chǔ)上，首先考查山茶油樣品的酸價、過氧化值和碘值，初步判明樣品品質(zhì)，并將變質(zhì)樣品作為參照物，在考查了樣品提取溶劑、色譜檢測波長、色譜柱流動相組成的條件下，最終確定采用HPLC-DAD進行指紋圖譜測定的最佳色譜條件：色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）和1%磷酸（B）；梯度洗脫；梯：0～20 min，95%A，5%B；20～50 min，100%A；檢測波長為：230 nm、292 nm；進樣量：10μL；流速為：1 m L·min-1；柱溫：30℃。并采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件對各個樣品的高效液相指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表明不同產(chǎn)地山茶油中在230 nm和292 nm波長下有吸收成分的含量有差異。但還是能挑選出幾個產(chǎn)地的樣品指紋圖譜相似度在0.7以上，而作為陽性對照品的S1相似度顯著異于其他樣品。表明本方法重現(xiàn)性好，具有一定的專屬性，可作為摻假山茶油鑒別的依據(jù)。

［1］ 黃麗嬌.山茶油摻偽檢驗方法研究［D］.南寧：廣西大學(xué)，2014.

［2］ 呂建云，孫豐霞.山茶油中四種功能性成分的測定［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2014，5（6）：1641-1646.

［3］ 海錚，王俊.基于電子鼻山茶油芝麻油摻假的檢測研究［J］.中國糧油學(xué)報，2006，21（3）：192-196.

［4］ 李帥鋒，鄭傳柱，張麗，等.不同產(chǎn)地何首烏HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2015，46（14）：2149-2154.

［5］ 馬麟，唐君蘋，曾寶，等.巴豆油的HPLC-ELSD指紋圖譜研究［J］.中國保健營養(yǎng)（中旬刊），2013（9）：30-31.

［6］ 馮華，劉英波，劉亮，等.黔產(chǎn)辣蓼及其混淆品高效液相指紋圖譜研究［J］.中草藥，2015，46（19）：2943-2945.

（責(zé)任編輯：張 韻）

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A

0528-9017（2016）07-1115-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160751

2016-03-03

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃項目（2014R420030）；浙江省教育廳研究項目（Y201432429）

賀加媛（1994—），女，浙江寧波人，從事色譜檢測工作，E-mai1：1115155644@qq.com。

饒桂維（1979—），男，實驗師，碩士，研究方向為食品儀器檢測，E-mai1：xianke1aifeng@163.com。