基于稀土元素指紋的扁形茶產地判別分析

王　潔，伊曉云，倪　康，景　進，石元值*，阮建云*（.中國農業(yè)科學院茶葉研究所農業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江杭州 30008；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京 0008）

基于稀土元素指紋的扁形茶產地判別分析

王潔1，2，伊曉云1，2，倪康1，景進1，2，石元值1*，阮建云1*
（1.中國農業(yè)科學院茶葉研究所農業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江杭州 310008；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

茶葉中稀土元素組成因氣候條件和土壤類型不同而有所差異，形成茶葉產地的稀土元素指紋。該研究通過測定不同產地扁形茶中稀土元素含量，借助統(tǒng)計學方法，探索建立茶葉產地區(qū)分模型。從山東日照、四川青川、貴州黎平、浙江龍井茶3個產區(qū)（西湖、越州和錢塘）采集了99個扁形茶春茶樣品，采用微波消解-電感耦合等離子體質譜法測定15種稀土元素的含量。結果表明，各地茶葉中稀土總量為0.11～2.48 mg·kg-1，以輕稀土為主，輕稀土分餾富集，而重稀土分餾貧化，表現(xiàn)出山東日照＞浙江＞貴州黎平＞四川青川的趨勢。根據(jù)各產區(qū)扁形茶中稀土元素含量，比較了主成分-線性判別分析、偏最小二乘法-線性判別分析、線性判別分析和神經網絡4種模型的扁形茶產地識別效果，其回帶驗證正確判別率分別為80.80%、87.90%、92.93%和95.05%，交叉驗證正確判別率分別為72.70%、81.80%、84.8%和75.50%。表明基于稀土元素指紋的4種模型能夠有效判別扁形茶的產地來源，稀土元素指紋是可以用于茶葉產地溯源的有效指標。

扁形茶；產地溯源；線性判別分析；稀土元素

文獻著錄格式：王潔，伊曉云，倪康，等.基于稀土元素指紋的扁形茶產地判別分析［J］.浙江農業(yè)科學，2016，57（7）：1118-1124.

龍井茶是浙江3個產區(qū)的著名地方特色產品，分為西湖龍井、錢塘龍井和越州龍井，均受原產地保護［1］。由于龍井茶特別是西湖龍井茶效益一直較好，被假冒事件時有發(fā)生，但鑒于扁形茶的外形與加工工藝與龍井茶基本一致，人們無法用肉眼直接識別其產地來源，如何防止西湖龍井茶等著名品牌茶葉被假冒一直是相關管理部門及茶葉生產者所關注的問題，亟須研發(fā)產地溯源與鑒別的方法以保護產地品牌。近年來，采用各種指紋圖譜對茶葉進行產地溯源已日益為人們所關注，常用技術有HPLC［2］、近紅外光譜［3-4］、微波消解-電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）［5-6］等。已有研究表明，茶葉中的元素含量具有產地指紋特性，通過ICP-MS/AES等手段分析茶葉中多種元素含量，運用主成分分析（PCA）、線性判別分析（LDA）、聚類分析、逐步判別分析、人工神經網絡（ANN）等方法對不同產地的茶葉進行判別，能取得較好的判別結果［5-9］。

茶葉中稀土元素（rare earth element，REE）含量因種類［10-13］和產區(qū)不同而有所差異，以稀土元素作為判別指標進行茶葉產地判別的研究已日益為人們所關注。稀土元素是指原子序數(shù)為57（La）～71（Lu）的鑭系元素，包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu，另外也包括39號Y。通常把原子序數(shù)較小的REE（La～Eu）稱為輕稀土元素（LREE），而將原子序數(shù)較大的REE（Gd～Lu）稱為重稀土元素（HREE）。本文對稀土元素是否能應用于茶葉的產地識別進行了探索，為排除加工工藝等因素的影響，本研究選取加工工藝一致的不同產地扁形茶為研究對象，測定其稀土元素含量，通過統(tǒng)計學方法進行數(shù)據(jù)處理，并基于稀土元素指紋建立不同產區(qū)茶葉判別模型，對不同產地扁形茶稀土含量地域特征在產地識別中的應用效果進行研究，以期為龍井茶等知名茶葉品牌的原產地保護提供鑒定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

根據(jù)扁形茶的主要產地分布和加工工藝，本研究從加工工藝基本一致的山東日照（SD，棕壤）、四川青川（SC，黃壤）、貴州黎平（GZ，黃壤）、龍井茶西湖（XH，紅壤）、越州（YZ，紹興越城區(qū)、嵊州市、新昌縣，均為紅壤）、錢塘（QT，富陽市、余杭區(qū)、淳安縣，均為紅壤）產區(qū)選擇了99個茶葉樣品。其中龍井茶產區(qū)樣本有55個，四川青川17個，貴州黎平12個，山東日照15個。茶葉樣品采取定點取樣方式獲得，加工時間因當?shù)匚锖蚱诓町惗兴煌綎|日照茶區(qū)采摘時間集中在4月15日至5月25日，其他茶區(qū)集中在4月1—25日。采樣時，每一地區(qū)均選擇了第3批（早）、第6批（中）、第9批（晚）采摘的1芽1葉新梢，并根據(jù)龍井茶工藝制成茶葉樣品；取樣時選取了當?shù)卮硇圆铇淦贩N：龍井43和當?shù)胤N。

1.2REE含量檢測

稱取0.3 g經球磨機（MM301，德國，Retsch）磨碎的樣品于高壓消解罐中，加入5 m L 70%HNO3（優(yōu)級純，美國，Thermo Fisher Scientific）加蓋靜置1 h。高壓消解罐使用前經20%硝酸浸泡過夜，超純水清洗、晾干。將靜置后的樣品放入微波消解儀進行消解，消解程序參數(shù)：5 min升至120℃保持5 min，5 m in升至140℃保持10 m in，5 min升至180℃保持10 m in，冷卻后取出，緩慢打開罐蓋排氣，將高壓消解罐置于控溫電熱板上140℃趕酸，將消化液轉移至25 m L容量瓶中，超純水定容至刻度，混勻備用［14］。

稀土元素含量由ICP-MS（AURORA M90，德國，BRUKER公司）測定，ICP-MS的工作參數(shù)為：射頻功率1 400 W，冷卻氣流速18 L·m in-1，輔助氣流速1.65 L·min-1，霧化器流速0.95 L· min-1，鞘氣流速0.25 L·min-1，采樣高度6.5 mm，泵穩(wěn)定時間30 s。

內標溶液。一定體積的1 000μg·m L-1Rh、In、Re混合標準溶液（中國計量科學研究院），用1%HNO3稀釋為1μg·mL-1，由內標管在線引入質譜儀。

儀器調諧貯備液。10μg·m L-1Be、Mg、Co、In、Ce、T1調諧貯備液用1%HNO3稀釋為1 ng· m L-1，備用。

標準曲線繪制。用1%稀硝酸將稀土元素混合標準貯備液（100μg·m L-1，含15種稀土元素La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y）逐級稀釋為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0μg·L-1的混合標準溶液。在ICPMS的工作條件下采集空白溶液（1%HNO3）和標準溶液系列，由儀器自動繪制標準曲線。

1.3數(shù)據(jù)處理

稀土元素總量為上述測定的15種稀土元素含量之和，計算各元素含量占總量的百分比、LREE（La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu）與HREE（其他稀土元素）之比。

采用單因素方差分析和最小顯著性差異（LSD）多重比較方法比較稀土元素含量在不同產地間的差異。采用主成分-線性判別分析（PCALDA）、偏最小二乘法-線性判別分析（PLS-LDA）、LDA和神經網絡（BP-ANN）對不同產地茶葉進行判別。

上述統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0、SIMCA 13.0.3和R 3.2.0完成。

2　結果與分析

2.1不同地區(qū)茶葉稀土元素含量差異

99份茶葉樣品的稀土元素含量為0.11～2.48 mg·kg-1，不同產區(qū)扁形茶中稀土總量均值為0.26～0.95 mg·kg-1。圖1表明，不同產地扁形茶之間的稀土元素總量存在顯著差異，表現(xiàn)出山東日照茶＞浙江龍井茶＞貴州黎平茶＞四川青川茶的分布趨勢，浙江龍井茶中的稀土元素含量均值略高于貴州黎平茶，但其差異性未達到顯著水平。

茶葉15種稀土元素含量和占稀土元素總量的布趨勢（P＜0.05），但Eu含量略有不同，山東顯著高于其他3省，表現(xiàn)出山東日照＞浙江龍井＞貴州黎平、四川青川的分布趨勢，其差異達到顯著水平。

圖1　不同產區(qū)扁形茶葉稀土元素總量

表1　不同產區(qū)扁形茶葉15種稀土元素含量和組成比例

表2　主成分分析的特征向量及累計方差貢獻率

2.2產地判別分析方法比較

基于上述不同產地間扁形茶中稀土元素間含量的差異性，比較了4種判別模型在不同產地扁形茶產地區(qū)分中的應用效果。

2.2.1主成分-線性判別分析

對15種稀土元素進行主成分分析，結果表明，前2個主成分的累計方差貢獻率為96.994%，提取前6個主成分（累計方差貢獻率為99.717%），其載荷值見表2，以主成分得分分別作圖（圖2中A、B、C），由圖可知第1和4主成分能夠較好地區(qū)分各地樣本，單獨以第1和4主成分作圖，山比例如表1所示。6種LREE總含量范圍為0.21～0.76 mg·kg-1，占稀土總量的80%左右；HREE含量為0.058～0.190 mg·kg-1，占稀土總量的20%左右；LREE/HREE值為3.5～4.3，說明茶葉中稀土元素以輕稀土為主，輕稀土表現(xiàn)出分餾富集，而重稀土表現(xiàn)出分餾貧化，符合植物稀土元素分餾的一般規(guī)律［13］。

各地區(qū)間稀土元素含量變化表現(xiàn)出一定相似性。各元素含量基本呈現(xiàn)出山東日照最高，浙江龍井次之，貴州黎平、四川青川較低的趨勢。經過最小顯著性差異多重比較檢驗后，不同產區(qū)扁茶中各稀土元素含量也總體上表現(xiàn)出與稀土總量一致的分東、貴州、四川樣本基本可以實現(xiàn)分離，但這3個地區(qū)的樣本與浙江樣本存在交叉，不能夠與浙江樣本分離（圖2中D）。以6個主成分為變量進行線性判別分析，提取到3個判別函數(shù)（discrimination function，DF），以前2個典型判別函數(shù)得分作圖（圖3），山東、四川、貴州3地樣本已完全分離，與浙江樣本略有交叉。所得判別模型（pc表示主成分）如下：

圖2　PCA得分情況

圖3　不同產區(qū)扁形茶前2個典型判別函數(shù)的得分散點

模型的回代驗證正確判別率達到80.80%，交叉驗證正確判別率為72.70%，能夠較為有效地實現(xiàn)各地樣本的產地判別。

2.2.2偏最小二乘法-線性判別分析

對原始數(shù)據(jù)進行偏最小二乘法判別分析后，按照2.2.1的方式進行線性判別分析，得到如下判別模型：

模型提取到3個典型判別函數(shù)，方差貢獻率分別為82.52%、15.04%和2.44%。以前2個典型判別函數(shù)得分作圖，樣本分離程度與圖3類似（圖4），但使用該模型的回代驗證正確判別率為87.9%，交叉驗證正確判別率為81.8%，模型的正判率高于PCA-LDA模型。

圖4　不同產區(qū)扁形茶前2個典型判別函數(shù)的得分散點圖

2.2.3線性判別分析

基于15種稀土元素含量，建立產地的LDA判別模型。判別模型如下：

提取模型前3個典型判別函數(shù)DF1、DF2、DF3，方差貢獻率分別為66.73%、25.12%、8.14%。以前2個判別函數(shù)的得分作圖（圖5），各地樣本分布較為集中，山東日照、四川青川、貴州黎平的樣品可完全區(qū)分開，3地樣品與浙江樣品雖然有交叉，但仍可與浙江樣品大致區(qū)分開來。經過回代檢驗和交叉驗證，判別分析結果如表3所示，回代檢驗正確判別率為92.93%，交叉驗證判別率為84.84%，除山東樣本的交叉驗證正確判別率較低外，其他地區(qū)的回代檢驗和交叉驗證正確判別率均在80%以上（表3）。

圖5　不同產區(qū)扁形茶前2個典型判別函數(shù)的得分散點

表3　不同地區(qū)茶葉稀土元素線性判別分析結果

2.2.4神經網絡

采用神經網絡中使用較為廣泛的反向傳播算法（back-propagation，BP）對樣本進行產地鑒別。建模過程中使用試錯法（trai1-and-erro）確定隱藏節(jié)點數(shù)，最終確定隱藏節(jié)點數(shù)為5時樣本的正確判別率較高。最終選擇5個隱藏節(jié)點、200次迭代、decay值0.000 5，rang值0.1進行建模。

將模型隨機運行20次得到表4，回代驗證正確判別率基本都在90%以上，交叉驗證正確判別率較低，多在70%～83%，20次模型運行回代驗證和交叉驗證的平均正確判別率分別為95.05%和75.50%。表明采用神將網絡方法可以實現(xiàn)樣本產地鑒別。

表4　BP-ANN判別結果

3　小結與討論

不同地區(qū)茶葉稀土元素含量及組成間存在顯著差異，不同產地的稀土元素指紋可為龍井茶等扁形茶的產地區(qū)分提供一個新的方法，基于稀土元素指紋的PCA-LDA、PLS-LDA、BP-ANN和LDA模型能夠識別扁形茶的產地來源，為今后西湖龍井等知名茶葉品牌的原產地保護提供了鑒定基礎。

樣品中稀土元素含量為0.11～2.48 mg·kg-1，根據(jù)GB 5009.94—2012《食品國家安全標準植物性食品中稀土元素的測定》提供的稀土氧化物換算系數(shù)，得到稀土氧化物總量為0.14～2.97 mg· kg-1，各地區(qū)稀土總量均值為0.26～0.95 mg· kg-1。La、Ce、Nd和Y 4種元素含量占到稀土總量的80%以上，其中Ce含量占稀土總量的35%左右。江蘇綠茶中稀土含量為0.38～1.72 mg· kg-1［13］，雒婉霞等［15］測定了烏魯木齊市售綠茶的稀土元素含量，其稀土氧化物含量為0.001 9～9.120 0 mg·kg-1。由此可見，不同產地綠茶稀土元素含量差異較大。土壤中稀土含量分布與茶葉中稀土的組成特征曲線基本相似［12］，茶葉由于其多年生特性，對產地環(huán)境的元素吸收更可能反映產地的元素分布特征。通過取樣已經排除了茶類和加工工藝的影響，因此，可以認為影響供試樣品中稀土元素含量的主要因素來自土壤。我國6種土壤中稀土總量大小排序為：磚紅壤＞黃棕壤、白漿土＞褐土＞淋溶黑鈣土＞紅壤［16］，山東日照采樣茶園屬棕壤，浙江采樣茶園屬紅壤，貴州以及四川采樣茶園屬黃壤。由于不同地區(qū)土壤類型有所不同，棕壤的山東日照地區(qū)稀土總量顯著高于紅壤地區(qū)。

茶葉是一種明顯帶有地理標志特征的產品，許多學者通過礦質元素指紋對不同地區(qū)茶葉進行了產地或者種類判別方面的研究，其正確判別率都較高［6，8-9］，單純通過稀土元素指紋進行茶葉產地溯源的研究較少。本研究選擇扁形茶作為判別分析對象，基于稀土元素指紋分別采用PCA-LDA、PLSLDA、BP-ANN和LDA對4地茶葉進行產地鑒別，能較好地將各地茶葉區(qū)分開。袁玉偉等［17］采用主成分分析結合線性判別分析的方法對福建、山東和浙江3省的茶葉進行產地判別，其正確判別率達到99%，這種方法在稻米中也有應用，并且正確判別率也較高［18］。本研究中此方法的正確判別率在80%以上，對比來看，文獻［17］和［18］中采用的建模指標包含同位素比率以及多元素含量在內達到30多個，尤其同位素比率等指標對產品地域有非常好的指示效果［19］，因此，單純基于稀土元素指紋采用該方法進行產地鑒別會存在一定局限性，從而導致正確判別率略低。根據(jù)PCA-LDA分析方法的思路，本研究嘗試進行了PLS-LDA進行產地鑒別，其正確判別率要高于PCA-LDA建立的模型。

林昕等［20］采用包含稀土元素在內的25種元素含量對普洱茶進行產地溯源，采用的BP-ANN算法的回代驗證正確判別率達97%以上，本研究中采用該算法也取得了較高的正確判別率。劉宏程等［21］采用電感耦合等離子發(fā)射光譜質譜法測定了西雙版納、普洱市、臨滄市3大普洱茶主產區(qū)共85個普洱茶樣本中16種稀土元素含量，進行逐步判別分析，可以較好地區(qū)分3大茶區(qū)樣本，在其他植物的產地溯源研究中基于礦物元素指紋的LDA模型也有較高正確判別率［22-23］。因此，可以認為基于稀土元素指紋的BP-ANN和LDA模型能夠有效判別扁形茶的產地來源。

［1］ 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.地理標志產品龍井茶：GB/T 18650—2008［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［2］ 王麗鴛，成浩，賀巍，等.不同產區(qū)龍井茶相似性及線性判別［J］.浙江林業(yè)科技，2014，34（2）：18-23.

［3］ 周健，成浩，曾建明，等.基于近紅外的多相偏最小二乘模型組合分析實現(xiàn)茶葉原料品種鑒定與溯源的研究［J］.光譜學與光譜分析，2010（10）：2650-2653.

［4］ YAN SM，LIU JP，XU L，et al.Rapid discrim ination of the geographical origins of an Oolong tea（Anxi-Tieguanyin）by near-infrared spectroscopy and partialleast squares discrim inan t analysis［J］.Jou rnal of Analytical Methods in Chem istry，2014，2014：1-6.

［5］ MARCOS A，F(xiàn)ISHER A，REA G，et al.Preliminary study using trace element concentrations and a chemometrics app roach to determine the geographical origin of tea［J］.Journal of AnalyticalAtomic Spectrometry，1998，13（6）：521-525.

［6］ FERNANDEZ P L，PABLOS F，MARTIN M J，et al.Mu1tielement analysis of tea beverages by inductive1y coupled plasma atom ic em ission spectrometry［J］.Food Chem istry，2002，76（4）：483-489.

［7］ MOREDA-PINEIRO A，F(xiàn)ISHER A，H ILL S J.The classification of tea according to region of origin using pattern recognition techniques and trace metal data［J］.Journal of Food Composition&Analysis，2003，16（2）：195-211.

［8］ PILGRIM T S，WATLING R J，GRICE K.Application of trace element and stable isotope signatures to determine the provenance of tea（Camellia sinensis）samples［J］.Food Chemistry，2010，118（4）：921-926.

［9］ 龔自明，王雪萍，高士偉，等.礦物元素分析判別綠茶產地來源研究［J］.四川農業(yè)大學學報，2012，30（4）：429-433.

［10］ 向麗萍，王奧，羅硯文，等.貴州綠茶中的稀土元素含量特征［J］.湖北農業(yè)科學，2014，53（1）：197-199.

［11］ 寧蓬勃，龔春梅，張彥明，等.應用ICP-AES法研究云南普洱茶稀土含量［J］.光譜學與光譜分析，2010，30（10）：2830-2833.

［12］ 駱和東，王文偉，王婷婷，等.福建省地產茶葉中稀土元素的組成特征及分布模式的研究［J］.衛(wèi)生研究，2014，26（6）：953-958.

［13］ 王峰，曹福亮.江蘇綠茶中稀土元素的組成特征及分布模式［J］.南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2012，36（4）：71-74.

［14］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標準：植物性食品中稀土元素的測定GB5009.94—2012［S］.北京：中國標準出版社，2012.

［15］ 雒婉霞，趙清榮，李菁，等.烏魯木齊地區(qū)市售綠茶中稀土元素含量調查［J］.疾病預防控制通報，2015，30（3）：74-76.

［16］ 王立軍，王玉琦，章申，等.中國不同類型土壤中稀土元素的形態(tài)分布特征［J］.中國稀土學報，1997，1（1）：65-71.

［17］ 袁玉偉，張永志，付海燕，等.茶葉中同位素與多元素特征及其原產地PCA-LDA判別研究［J］.核農學報，2013，27（1）：47-55.

［18］ 邵圣枝，陳元林，張永志，等.稻米中同位素與多元素特征及其產地溯源PCA-LDA判別［J］.核農學報，2015，29（1）：119-127.

［19］ 郭波莉，魏益民，潘家榮.同位素指紋分析技術在食品產地溯源中的應用進展［J］.農業(yè)工程學報，2007，23（3）：284-289.

［20］ 林昕，沙嶺杰，蘭珊珊，等.在普洱茶產地溯源中化學計量學工具的應用研究［J］.食品安全質量檢測學報，2015，6（9）：3646-3653.

［21］ 劉宏程，林昕，和麗忠，等.基于稀土元素含量的普洱茶產地識別研究［J］.茶葉科學，2014，34（5）：451-457.

［22］ 趙海燕.小麥產地礦物元素指紋信息特征研究［D］.北京：中國農業(yè)科學院，2013.

［23］ 馬奕顏.獼猴桃產地溯源指紋信息篩選與驗證研究［D］.北京：中國農業(yè)科學院，2014.

（責任編輯：侯春曉）

S571.1

A

0528-9017（2016）07-1118-07

10.16178/j.issn.0528-9017.20160752

2016-02-29

公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201203046）；中國農業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS-03）；浙江省基金項目（LY13C150002）

王 潔（1988—），女，山東淄博人，碩士研究生，從事茶葉離子組學研究工作，E-mai1：wangjie@tricaas.com。

阮建云，E-mai1：jruan@tricaas.com；石元值，E-mai1：shiyz@tricaas.com。